检测呼吸道感染相关的病原体的试剂盒及方法与流程

1.本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种检测呼吸道感染相关的病原体的试剂盒及方法。


背景技术：

2.据世卫组织统计，全球约260万人死于呼吸道感染，发病率高达0.05%~0.12%。而急性呼吸道感染大多主要是由病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体侵染人体鼻咽部、肺部、支气管等部位引起的，其中病毒占70%左右，检出的病原体占比较多的为甲乙流病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、人偏肺病毒、呼吸道腺病毒等。而约20%是由细菌引起，主要检出为肺炎链球菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌等。目前呼吸道感染检测方法一般有病原体分离培养法、涂布镜检法、pcr法、基于酶联免疫学的方法。多于对种病原体共检测的方法有多重pcr法、宏基因组技术、dna微阵列、液相芯片技术等。
3.其中，多重pcr以成本低、适用于同时检测多种病原体等优势广泛应用于病原体的检测。
4.然而，现有的呼吸道感染病原体的检测试剂盒，覆盖的呼吸道感染相关病原体不够全面，且大部分只能定位到病原体的属或种，检测具有局限性。


技术实现要素：

5.本公开有鉴于上述现有技术的状况而完成，其目的在于提供一种检测呼吸道感染相关的病原体的试剂盒及方法，所检测的病原体更加全面，且对于部分病原体包括从属到种、或从种到亚种的检测位点，能够提高检测的检出率，同时能够进行多重验，提高检测结果的真实性。
6.为此，本公开第一方面提供一种检测呼吸道感染相关的病原体的试剂盒，所述试剂盒包括对第一病原体的基因和第二病原体的基因的靶标区域进行检测的引物组，所述引物组包括第一正向引物和第一反向引物，所述第一正向引物包括第一测序引物和与所述靶标区域5’端相匹配的上游引物；所述第一反向引物包括第二测序引物和与所述靶标区域3’端相匹配的下游引物；其中，所述第一病原体和所述第二病原体为与呼吸道感染相关的病原体，且所述第一病原体包括所述第二病原体；所述第一病原体包含冠状病毒α属、冠状病毒β属、冠状病毒δ属、冠状病毒γ属、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、非结核分枝杆菌和流感嗜血杆菌；所述上游引物包括基于所述第一病原体的基因的靶标区域设计的通用上游引物或基于所述第二病原体的基因的靶标区域设计的物种上游引物；所述下游引物包括基于所述第一病原体的基因的靶标区域设计的通用下游引物或基于所述第二病原体的基因的靶标区域设计的物种下游引物。
7.在本公开的试剂盒中，包括能够对第一病原体和第二病原体进行检测的引物组，其中第二病原体从属于第一病原体，在这种情况下，第一病原体的引物组和第二病原体的引物组之间能够对检测结果进行相互验证，提高检测的真实性。举例而言，对于某个样本而
言，某种第二病原体检测结果为阳性，那么该第二病原体所对应的第一病原体的检测结果也需为阳性，若该第二病原体为阳性但对应的第一病原体的检测结果为阴性，则需要对结果进行进一步的验证（验证方法例如可以为采用其他的方法学对该样本的该病原体进行检测），由此能够提高检测结果的真实性。此外，若该样本的该第二病原体的检测结果为阴性但对应的第一病原体的检测结果为阳性，则说明该样本中存在第二病原体外的病原体的基因，由此能够提高检测的检出率。另外，第一病原体包含冠状病毒α属、冠状病毒β属、冠状病毒δ属、冠状病毒γ属、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、非结核分枝杆菌和流感嗜血杆菌，对于呼吸道感染相关的病原体覆盖较全面，因此还具有检测全面性较高的好处。综上，本公开所提供的试剂盒，检测全面性高、检出率高、真实性好。
8.在本公开所涉及的试剂盒中，可选地，所述第二病原体包含冠状病毒229e、冠状病毒nl63、冠状病毒oc43、冠状病毒hku1、中东呼吸综合征冠状病毒、sars病毒、新型冠状病毒、甲型h1n1流感病毒、甲型h3n2流感病毒、甲型h5n1流感病毒、甲型h7n9流感病毒、乙型流感病毒victoria系、乙型流感病毒yamagata系、腺病毒b组、腺病毒c组、腺病毒e组、脓肿分枝杆菌、胞内分支杆菌、鸟分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、土分枝杆菌、龟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和b型流感嗜血杆菌。由此，能够更加全面地覆盖呼吸道感染相关病原体。
9.在本公开所涉及的试剂盒中，可选地，包括对第三病原体的基因的靶标区域进行检测的引物组，所述第三病原体包含副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、呼吸道合胞病毒a型、呼吸道合胞病毒b型、鼻病毒、人类偏肺病毒、博卡病毒、风疹病毒、麻疹病毒、尼帕病毒、腮腺炎病毒、水痘带状疱疹病毒、结核分枝杆菌复合群、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌、嗜肺军团菌、副流感嗜血杆菌、诺卡氏菌、脑膜炎奈瑟菌、耶氏肺孢子虫、肺炎支原体和肺炎衣原体；所述上游引物包括基于所述第三病原体的基因的靶标区域设计的通用上游引物或基于所述第三病原体的基因的靶标区域设计的物种上游引物；所述下游引物包括基于所述第三病原体的基因的靶标区域设计的通用下游引物或基于所述第三病原体的基因的靶标区域设计的物种下游引物。由此，能够更加全面地覆盖呼吸道感染相关病原体。
10.在本公开所涉及的试剂盒中，可选地，所述引物组包括第二反向引物、第二正向引物和第三反向引物，所述第二反向引物包括所述第二测序引物、第一条形码和第一测序接头，所述第一条形码配置为识别不同的样本；所述第二正向引物包括第二测序接头和所述第一测序引物；所述第三反向引物包括所述第一测序接头。
11.在本公开所涉及的试剂盒中，可选地，所述第一正向引物从5’端到3’端依次为所述第一测序引物和与所述目标区域5’端相匹配的序列，所述第一反向引物从5’端到3’端依次为所述第二测序引物和与所述目标区域3’端相匹配的序列，所述第二反向引物从5’端到3’端依次为所述第一测序接头、所述第一条形码和所述第二测序引物，所述第二正向引物从5’端到3’端依次为所述第二测序接头和所述第一测序引物，所述第三反向引物为所述第一测序接头。
12.在本公开所涉及的试剂盒中，可选地，所述第一测序引物和所述第二测序引物为illumina测序平台的测序引物，所述第一测序接头为illumina测序平台的p7接头，所述第二测序接头为illumina测序平台的p5接头，所述第一条形码为6~12bp的随机碱基序列。由此，能够使目标文库适用于illumina测序平台。
13.在本公开所涉及的试剂盒中，可选地，所述病原体中的各个病原体分别具有3个靶标区域，所述上游引物和所述下游引物包括各个病原体的3个靶标区域中的至少1个靶标区域所对应的上游引物和下游引物。
14.在本公开所涉及的试剂盒中，可选地，所述上游引物和所述下游引物为各个病原体的3个靶标区域所对应的上游引物和下游引物。由此，对于每个病原体的基因均检测3个靶标区域，能够提高检测准确率。
15.本公开第二方面提供一种以非诊断目的检测呼吸道感染相关的病原体的方法，包括：准备待测核酸样本；使用如本公开第一方面所提供的试剂盒对所述待测核酸样本进行pcr扩增，得到目标文库；对所述目标文库进行测序分析，获得测序数据；以及基于所述测序数据得到检测结果。由此，能够对呼吸道感染相关的病原体进行检测。
16.在本公开所涉及的方法中，可选地，使用所述第一正向引物、所述第一反向引物和第二反向引物对所述待测核酸样本进行第一轮pcr扩增，得到第一轮pcr扩增产物；使用第二正向引物和第三反向引物对所述第一轮pcr扩增产物进行第二轮pcr扩增，得到所述目标文库。
17.根据本公开，能够提供一种检测呼吸道感染相关的病原体的试剂盒及方法，所检测的病原体更加全面，且对于部分病原体包括从属到种、或从种到亚种的检测位点，能够提高检测的检出率，同时能够进行多重验，提高检测结果的真实性。
附图说明
18.图1示出本公开的示例所涉及的检测呼吸道感染相关的病原体的引物组、试剂盒、方法及应用的场景示意图。
19.图2示出本公开的示例所涉及的从病原体的基因中选取多个靶标区域的示意图。
20.图3示出本公开的示例所涉及的引物组对靶标区域进行pcr扩增的过程示意图。
21.图4示出本公开的示例所涉及的试剂盒的示意图。
22.图5示出本公开的示例所涉及的检测呼吸道感染相关的病原体的方法的流程图。
23.图6示出本公开的示例所涉及的pcr扩增的流程图。
24.图7示出本公开的示例所涉及的pcr扩增与纯化的流程图。
25.图8示出本公开的示例所涉及的pcr扩增的场景示意图。
具体实施方式
26.以下，参考附图，详细地说明本公开的优选实施方式。在下面的说明中，对于相同的部件赋予相同的符号，省略重复的说明。另外，附图只是示意性的图，部件相互之间的尺寸的比例或者部件的形状等可以与实际的不同。
27.需要说明的是，本发明中的术语“包括”和“具有”以及它们的任何变形，例如所包括或所具有的一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可以包括或具有没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
28.另外，在本发明的下面描述中涉及的小标题等并不是为了限制本发明的内容或范围，其仅仅是作为阅读的提示作用。这样的小标题既不能理解为用于分割文章的内容，也不
应将小标题下的内容仅仅限制在小标题的范围内。
29.本公开涉及一种检测呼吸道感染相关的病原体的引物组（以下有时简称为“引物组”）、一种引物组在制备检测呼吸道感染相关的试剂中的应用（以下有时简称为“应用”）、一种检测呼吸道感染相关的病原体的试剂盒（以下有时简称为“试剂盒”）、以及一种检测呼吸道感染相关的病原体的方法（以下有时简称为“方法”或“检测方法”）。本公开涉及的检测呼吸道感染相关的病原体的引物组、试剂盒、应用和方法，所检测的病原体更加全面，且对于部分病原体包括从属到种、或从种到亚种的检测位点，达到多重验证的效果，提高检测的检出率和真实性。具有检测全面性高、检出率高的效果。
30.病原体是指能引起疾病或传播疾病的媒介的总称，包括病毒、细菌、真菌和寄生虫等。通过对检测样本中的病原体基因的存在情况进行检测，能够对疾病进行辅助诊断，帮助后续对症治疗等。
31.本公开涉及的引物组、试剂盒、应用和方法，可以对各个病原体基因的靶标区域进行检测，靶标区域可以是选自病原体基因中的保守区域。换言之，靶标区域可以是选自该病原体所特有的基因或基因片段，通过检测靶标区域，能够识别病原体。
32.本公开涉及的引物组、试剂盒、应用和方法，可以对呼吸道感染相关的病原体进行检测。换言之，检测对象为呼吸道感染相关的病原体。呼吸道感染相关的病原体可以指能够引起呼吸道感染的一种或多种病原体。
33.在一些示例中，在本公开涉及的引物组、试剂盒、应用和方法中，呼吸道感染相关的病原体可以包括病毒类病原体、细菌类病原体和其他微生物。换言之，检测对象包括呼吸道感染相关的病毒类病原体、细菌类病原体和其他微生物。
34.本公开涉及的引物组、试剂盒、应用和方法，可以对常见的呼吸道感染相关病原体进行检测，其中，部分病原体从属（种）到种（亚种或血清型）均进行检测。由此，能够增加检出率与真实性。
35.以下，结合附图对本公开涉及的检测呼吸道感染相关的病原体的引物组、试剂盒、方法及应用进行说明。
36.图1示出了本公开的示例所涉及的检测呼吸道感染相关的病原体的引物组、试剂盒、方法及应用的场景示意图。
37.在本实施方式中，如图1所示，通常可以从待测对象例如人体中获取得到待测核酸样本20。其中，待测核酸样本20的数量可以为多个，例如包括待测核酸样本21、待测核酸样本22、待测核酸样本23等。随后，例如可以使用pcr仪400对待测核酸样本进行pcr扩增。接着，再经测序仪500进行测序，得到各个待测核酸样本的序列信息（参见图1）。
38.在一些示例中，本实施方式所涉及的引物组可以用于对待测核酸样本进行pcr扩增。
39.在一些示例中，引物组可以指对病原体的基因的靶标区域进行检测的引物组。
40.在一些示例中，病原体的种类可以是多种。换言之，本实施方式所涉及的引物组可以对多种病原体进行检测。在本实施方式中，引物组可以对呼吸道感染相关的病原体同时进行检测。
41.在一些示例中，本实施方式所涉及的病原体可以包括第一病原体和第二病原体。换言之，本实施方式所述涉及的引物组可以对第一病原体和第二病原体进行检测。
42.在一些示例中，第一病原体可以包括第二病原体。换言之，第二病原体从属于第一病原体。
43.在一些示例中，第一病原体可以包括冠状病毒α属、冠状病毒β属、冠状病毒δ属、冠状病毒γ属、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、非结核分枝杆菌和流感嗜血杆菌。
44.在一些示例中，第二病原体可以包括冠状病毒229e、冠状病毒nl63、冠状病毒oc43、冠状病毒hku1、中东呼吸综合征冠状病毒、sars病毒、新型冠状病毒、甲型h1n1流感病毒、甲型h3n2流感病毒、甲型h5n1流感病毒、甲型h7n9流感病毒、乙型流感病毒victoria系、乙型流感病毒yamagata系、腺病毒b组、腺病毒c组、腺病毒e组、脓肿分枝杆菌、胞内分支杆菌、鸟分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、土分枝杆菌、龟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和b型流感嗜血杆菌。
45.在一些示例中，靶标区域可以是选自病原体的基因中的保守区域。换言之，靶标区域可以是选自该病原体所特有的基因或基因片段，通过检测靶标区域，能够识别病原体。
46.在一些示例中，病原体的基因的序列是已知或公开的，可以通过公共数据库查询或下载得到，例如美国国家生物技术信息中心（ncbi）的dna序列数据库（genbank），可以使用软件（例如clone manager）查找病原体基因的保守序列区域。在一些示例中，可以从病原体的基因的保守序列区域中选取靶标区域进行设计特异性引物。在一些示例中，设计特异性引物使可以增加引物中的简并碱基，由此能够提高保守区域的引物的覆盖度。由此，能够设计得到引物组，引物组能够对病原体基因的靶标区域进行pcr扩增。
47.在一些示例中，可以从每个病原体的基因中选取一个或多个靶标区域。例如从一个病原体的基因中选取1个、2个、3个、5个或10个靶标区域等。在一些示例中，从引物设计难度和成本考虑，可以从每个病原体的基因序列中选取2至5个靶标区域，并针对该2至5个靶标区域分别设计引物组。例如，可以从每个病原体的基因序列中选取2个、3个、4个或5个靶标区域。优选地，可以从每个病原体的基因序列中选取3个靶标区域。
48.图2示出本公开的示例所涉及的从病原体的基因中选取多个靶标区域的示意图。
49.在一些示例中，如图2所示，可以从病原体的基因10的基因序列中选取3个靶标区域即靶标区域100、靶标区域200和靶标区域300。
50.在一些示例中，从每个病原体的基因序列中选取的多个靶标区域，彼此之间可以不重叠。在另一些示例中，从每个病原体的基因序列中选取的多个靶标区域彼此之间也可以仅部分重叠。也就是说，从某个病原体的基因中选取多个靶标区域时，多个靶标区域之间不会完全重叠。由此，能够从每个病原体的基因序列中选取得到不同的多个靶标区域。
51.在一些示例中，可以针对每个靶标区域分别设计一个引物组。在一些示例中，每个引物组可以包括多个引物。在一些示例中，各个引物组可以分别包括第一正向引物和第一反向引物。在一些示例中，各个引物组还可以包括第二反向引物、第二正向引物和第三反向引物（稍后详细描述）。对于每个靶标区域而言，所设计的引物组中第一正向引物和第一反向引物通常是不同的（具有特异性），而第二反向引物、第二正向引物和第三反向引物是通用的。
52.在一些示例中，第一正向引物可以包括第一测序引物和与靶标区域的5’端相匹配的上游引物。在一些示例中，第一正向引物可以由第一测序引物和与靶标区域的5’端相匹配的上游引物组成。具体地，第一正向引物从其5’端到3’端可以依次为第一测序引物和与
靶标区域的5’端相匹配的上游引物。
53.在一些示例中，第一反向引物可以包括第二测序引物和与靶标区域的3’端相匹配的下游引物。在一些示例中，第一反向引物可以由第二测序引物和与靶标区域的3’端相匹配的下游引物组成。具体地，第一反向引物从其5’端到3’端可以依次为第二测序引物和与靶标区域的3’端相匹配的下游引物。
54.在一些示例中，基于第一病原体的基因的靶标区域设计的上游引物可以称为通用上游引物。基于第二病原体的基因的靶标区域设计的上游引物可以称为物种上游引物。
55.在一些示例中，基于第一病原体的基因的靶标区域设计的下游引物可以称为通用下游引物。基于第二病原体的基因的靶标区域设计的下游引物可以称为物种下游引物。
56.在这种情况下，包含通用上游引物的第一正向引物、包含通用下游引物的第一反向引物，和包含物种上游引物的第一正向引物和包括物种下游引的第一反向引物，结合起来对第一病原体和第二病原体进行检测，能够达到多重验证的效果，提高检测的检出率和真实性。
57.当然，本实施方式所涉及的引物组不限于此，在一些示例中，引物组还可以对第三病原体进行检测。由此，能够对呼吸道感染相关病原体的检测更加全面。
58.在一些示例中，第三病原体可以包括副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、呼吸道合胞病毒a型、呼吸道合胞病毒b型、鼻病毒、人类偏肺病毒、博卡病毒、风疹病毒、麻疹病毒、尼帕病毒、腮腺炎病毒、水痘带状疱疹病毒、结核分枝杆菌复合群、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌、嗜肺军团菌、副流感嗜血杆菌、诺卡氏菌、脑膜炎奈瑟菌、耶氏肺孢子虫、肺炎支原体和肺炎衣原体。
59.在一些示例中，可以基于第三病原体的基因的靶标区域的5’端设计上游引物（可以称为通用上游引物或物种上游引物）。在一些示例中，可以基于第三病原体的基因的靶标区域的3’端设计下游引物（可以称为通用下游引物或物种下游引物）。由此，第一正向引物和第一反向引物能够对第三病原体的基因的靶标区域进行捕获。
60.在一些示例中，在本实施方式中，某个病原体分别具有3个靶标区域，本实施方式的引物组中的上游引物和下游引物可以包括各个病原体的3个靶标区域中的至少1个靶标区域所对应的上游引物和下游引物。例如，如下表1所示的，针对冠状病毒229e这一病原体，其上游引物和下游引物可以是靶标区域1至靶标区域3中的至少一个靶标区域的上游引物和下游引物。优选地，本实施方式的引物组可以为各个病原体的3个靶标区域所对应的上游引物和下游引物。换言之，各个病原体均检测3个靶标区域。在这种情况下，能够提高检测准确率。
61.在一些示例中，本实施方式所涉及的病原体和引物序列信息可以如下表1至表15所示：表1：
表2：
表3：
表4：
表5：
表6：
表7：表8：
表9：表10：
表11：
表12：
表13：
表14：
表15：
在一些示例中，各个引物组还可以包括第二反向引物、第二正向引物和第三反向引物。
62.在一些示例中，引物组在用于对待测核酸样本进行检测时，可以使用第一正向引物、第一反向引物和第二反向引物对待测核酸样本进行第一轮pcr扩增并得到第一轮pcr扩增产物，再使用第二正向引物和第三反向引物对第一轮pcr扩增产物进行第二轮pcr扩增，以得到目标文库。
63.在一些示例中，第二反向引物可以包括第二测序引物、第一条形码和第一测序接头。在一些示例中，第二反向引物可以由第二测序引物、第一条形码和第一测序接头组成。具体地，第二反向引物从其5’端到3’端可以依次为第一测序接头、第一条形码和第二测序引物。
64.在一些示例中，第二反向引物中的第一条形码可以配置为用于识别不同待测核酸样本。也就是说，对同一个待测核酸样本所使用的第一条形码的序列是相同的，对不同的待测核酸样本使用的是不同的第一条形码。在一些示例中，至少在同一批次中的待测核酸样本使用的是不同的第一条形码，在这种情况下，通过在首次pcr扩增过程中使待测核酸样本添加第一条形码，能够减少气溶胶污染等对不同待测核酸样本的检测结果的影响。
65.在一些示例中，第一条形码可以为随机序列。例如第一条形码可以由若干碱基组
成，不同的碱基排序代表不同的第一条形码。在一些示例中，第一条形码可以为碱基数为6~12个的随机序列。例如第一条形码可以为碱基数为6、7、8、9、10、11或12个的随机序列。
66.在一些示例中，第二正向引物可以包括第二测序接头和第一测序引物。具体地，第二正向引物从其5’端到3’端可以依次为第二测序接头和第一测序引物。
67.在一些示例中，第二正向引物还可以包括第二条形码。具体地，第二正向引物从其5’端到3’端可以依次为第二测序接头、第二条形码和第一测序引物。第二条形码可以配置为识别不同批次的样本。也就是说，对同一批次的中的待测核酸样本所使用的第二条形码的序列是相同的，对不同批次的中的待测核酸样本所使用的第二条形码的序列是不同的。由此，能够减少气溶胶污染等对不同批次样本的检测结果的影响。
68.在一些示例中，第二条形码可以为随机序列。例如第二条形码可以由若干碱基组成，不同的碱基排序代表不同的第二条形码。在一些示例中，第一条形码可以为碱基数为6~12的随机序列。例如第一条形码可以为碱基数为6、7、8、9、10、11或12的随机序列。
69.在一些示例中，出于更方便进行测序数据分析的考虑，优选地，第二条形码可以与第一条形码不同。具体地，第二条形码的碱基数可以与第一条形码的碱基数不同，或者第二条形码的碱基序列可以与第一条形码的碱基序列不同。
70.在一些示例中，第三反向引物可以包括第一测序接头。在一些示例中，第三反向引物可以为第一测序接头。
71.在一些示例中，在第一轮pcr扩增过程中，第一正向引物可以作为靶标区域的正向引物，第一反向引物和第二反向引物可以作为靶标区域的反向引物，对靶标区域进行pcr捕获与扩增，得到第一轮pcr扩增产物。
72.在一些示例中，由于第一轮pcr扩增时可以通过第二反向引物使不同的待测核酸样本添加上不同的第一条形码，在第一轮pcr扩增完成后，可以将不同样本的第一轮pcr扩增产物进行混合，混合后统一进行第二轮pcr扩增。
73.在一些示例中，在第二轮pcr扩增过程中，第二正向引物可以作为第一轮pcr扩增产物的正向引物，第三反向引物可以作为第一轮pcr扩增产物的反向引物，对第一轮pcr扩增产物进行第二轮pcr扩增，得到目标文库。
74.在一些示例中，由第一正向引物、第一反向引物、第二反向引物、第二正向引物和第三反向引物的组成可知，在实际的引物设计时，主要是针对每个靶标区域单独设计第一正向引物和第一反向引物，而第二反向引物、第二正向引物和第三反向引物对于每个靶标区域可以是通用的，也即第二反向引物、第二正向引物和第三反向引物无需针对不同的靶标区域单独设计。
75.在一些示例中，与靶标区域100同样，针对靶标区域200，也可以设计并得到与靶标区域200的上下游特异性结合的第一正向引物和第一反向引物；第二反向引物、第二正向引物和第三反向引物为通用引物。同样地，针对靶标区域300，也可以设计得到与靶标区域300的上下游特异性结合的第一正向引物和第一反向引物；第二反向引物、第二正向引物和第三反向引物为通用引物。
76.对于多种病原体的情形，同样地，针对每个病原体的基因的各个靶标区域设计并得到与各个靶标区域的上下游特异性结合的第一正向引物和第一反向引物。而针对每个病原体的各个靶标区域的第二反向引物、第二正向引物和第三反向引物均为通用引物。
77.图3示出本公开的示例所涉及的引物组对靶标区域进行pcr扩增的过程示意图。
78.如图3所示，在一些示例中，在本公开的示例所涉及的引物组中，第一测序引物和第二测序引物可以为illumina测序平台的测序引物，第一测序接头可以为illumina测序平台的测序接头p7，第二测序接头可以为illumina测序平台的测序接头p5。由此，通过引物组对靶标区域进行扩增而得到的目标文库能够通过illumina测序平台进行测序，以得到测序数据。
79.在一些示例中，第一正向引物中的上游引物能够和靶标区域100的5’端互补配对，第一反向引物中的下游引物能够和靶标区域100的3’端互补配对。由此，第一正向引物、第一反向引物和第二反向引物可以用于对靶标区域100进行第一轮pcr扩增，得到第一轮pcr扩增产物101。第一轮pcr扩增产物101从其5’至3’端可以依次为第一测序引物、靶标区域100、第二测序引物、第一条形码和测序接头p7。
80.在一些示例中，第二正向引物和第三反向引物可以用于对第一轮pcr扩增产物101进行第二轮pcr扩增，得到目标文库102。目标文库102从其5’至3’端可以依次为测序接头p5、第一测序引物、靶标区域100、第二测序引物、第一条形码和测序接头p7。由此，得到的目标文库102能够直接用于illumina测序平台进行测序。
81.在另一些示例中，第一测序引物、第二测序引物、第一测序接头和第二测序接头也可以为其他测序平台的通用测序引物和通用测序接头，可以根据实际情况选择。
82.以下，结合附图4详细地描述本公开所涉及的检测呼吸道感染相关的病原体的试剂盒（以下简称为“试剂盒”）。图4示出本公开的示例所涉及的试剂盒1的示意图。
83.在本实施方式中，试剂盒1可以包括上述的引物组。在一些示例中，试剂盒1可以包括含有第一正向引物的试剂瓶810、含有第一反向引物的试剂瓶820、含有第二反向引物的试剂瓶830、含有第二正向引物的试剂瓶840、以及含有第三反向引物的试剂瓶850。关于第一正向引物、第一反向引物、第二反向引物、第二正向引物、第三反向引物以及病原体基因等物质，已经在上述对引物组进行说明时进行了详细描述，在此不再赘述。
84.在一些示例中，试剂盒1还可以包括人工质粒集合。人工质粒集合可以包括多种能够与第一正向引物和第一反向引物结合的人工质粒。其中，各种人工质粒可以基于不同病原体的靶标区域的序列而设计但又与靶标区域的序列具有差异。
85.在对多种病原体基因进行检测时，在多重pcr引物池中包含了成百上千种病原微生物特异扩增的引物，但在实际待测样本中，通常只存在少量种类的微生物甚至没有，在这种情况下，成百上千种引物只有某几对引物实际会发生扩增，剩余的大量引物会由于没有目标dna模板消耗，而形成大量的二聚体或者非特异扩增，进而导致扩增文库质量较差。在这种情况下，人工质粒集合通过与第一正向引物和第一反向引物结合，能够对体系中的第一正向引物和第一反向引物进行消耗，由此，能够减少引物二聚体的形成，提高文库质量。
86.在一些示例中，试剂盒1还可以包括阳性质控品、阴性质控品、反转录试剂、核酸提取试剂、建库试剂（包括pcr缓冲液、dna聚合酶、dntps等）、定量试剂、纯化试剂、测序试剂中的至少一种。这里，阳性质控品、阴性质控品、反转录试剂、核酸提取试剂、建库试剂（包括pcr缓冲液、dna聚合酶、dntps等）、定量试剂、纯化试剂、测序试剂可以是自制或市售的。
87.在一些示例中，阳性质控品可以是包括病原体的基因的靶标区域的样本，阴性质控品可以是不包括病原体的基因的靶标区域的样本。由此，能够提供针对病原体基因的各
个靶标区域的真阳性和假阳性样本，用于建立roc曲线以得到各个靶标区域的检出阈值，或用于进行阳性对照实验或阴性对照实验。
88.在一些示例中，试剂盒1还可以包括说明书，说明书可以记载如何使用本公开的试剂盒对呼吸道感染相关病原体进行检测，以及说明书还可以记载如何对检测结果进行判读。
89.根据本公开所涉及的试剂盒，所检测的病原体更加全面，且对于部分病原体包括从属到种、或从种到亚种的检测位点，达到多重验证的效果，提高检测的检出率和真实性。
90.此外，本公开还涉及一种引物组在制备检测呼吸道感染相关的试剂中的应用（以下简称为“应用”）。
91.在本公开所涉及的应用中，引物组是指上述的引物组。
92.根据本公开所提供的应用，所检测的病原体更加全面，且对于部分病原体包括从属到种、或从种到亚种的检测位点，达到多重验证的效果，提高检测的检出率和真实性。
93.此外，本公开还涉及一种检测呼吸道感染相关的病原体的方法（一些简称“方法”或“检测方法”）图5示出本公开的示例所涉及的检测呼吸道感染相关的病原体的方法的流程图。图6示出本公开的示例所涉及的pcr扩增的流程图。图7示出本公开的示例所涉及的pcr扩增与纯化的流程图。图8示出本公开的示例所涉及的pcr扩增的场景示意图。图7示出本公开的示例所涉及的pcr扩增与纯化的流程图。图8示出本公开的示例所涉及的pcr扩增的场景示意图。
94.在本实施方式中，如图5所示，检测呼吸道感染相关的病原体的方法可以包括以下步骤：准备待测核酸样本（步骤s10）；使用引物组或试剂盒1对待测核酸样本进行pcr扩增，得到目标文库（步骤s20）；对目标文库进行测序分析，获得测序数据（步骤s30）；基于测序数据得到检测结果（步骤s40）。
95.在一些示例中，检测呼吸道感染相关的病原体的方法可以包括准备待测核酸样本（步骤s10）。
96.在一些示例中，在步骤s10中，待测核酸样本可以从受检者中获取。例如，可以从受检者中采集可能包含待测病原体的组织、体液等的样本来获取待测核酸样本。在一些示例中，呼吸道感染相关的病原体的样本通常可以从受检者的咽拭子、鼻拭子、痰液、肺泡灌洗液、纤支镜防污染毛刷、外周血和浆膜腔积液中的至少一种方式来得到。
97.在一些示例中，可以利用核酸提取试剂盒来提取并得到待测核酸样本。其中，可以根据不同的样本类型，采用不同的核酸提取试剂盒进行提取。例如，可以使用dna提取试剂盒或rna提取试剂盒，也可以使用dna/rna共提试剂盒进行提取。在一些示例中，对于包含难破壁细胞的样本，可以提前采取超声波破壁，再进行核酸的提取。
98.在一些示例中，核酸提取完成后，可以用荧光定量试剂盒和荧光定量仪测定浓度，并尽量使各个核酸样本的核酸浓度均匀，这里，可以使用qubit试剂盒作为荧光定量试剂盒，使用qubit仪作为荧光定量仪。在一些示例中，提取得到的待测核酸样本可以在-20℃至-80℃的条件下进行保存。
99.在一些示例中，待测核酸样本可以包括dna样本和rna样本中的至少一种，并且若待测核酸样本包括rna样本，则在获取待测核酸样本之后，还包括对待测核酸样本进行反转
录的步骤。由此，能够对含rna样本的待测核酸样本进行检测。例如，若待测核酸样本为新型冠状病毒基因等rna样本时，需要将待测核酸样本进行反转录，反转录为dna样本。
100.在一些示例中，如上所述，检测呼吸道感染相关的病原体的方法可以包括使用引物组或试剂盒对待测核酸样本进行pcr扩增，得到目标文库（步骤s20）。这里所指引物组是指上面所描述的检测呼吸道感染相关的病原体的引物组。这里所指的试剂盒是指上面所描述的检测呼吸道感染相关的病原体的试剂盒。
101.如上所述，每个引物组可以包括多个引物。在一些示例中，各个引物组可以分别包括第一正向引物、第一反向引物、第二反向引物、第二正向引物和第三反向引物。第一正向引物从其5’端到3’端可以依次为第一测序引物和与靶标区域的5’端相匹配的序列。第一反向引物从其5’端到3’端可以依次为第二测序引物和与靶标区域的3’端相匹配的序列。第二反向引物从其5’端到3’端可以依次为第一测序接头、第一条形码和第二测序引物。第二反向引物中的第一条形码可以配置为用于识别不同待测核酸样本。第二正向引物从其5’端到3’端可以依次为第二测序接头、第二条形码和第一测序引物。第三反向引物可以为第一测序接头。在这种情况下，引物组能够对待测核酸样本进行pcr扩增并得到目标文库。
102.在一些示例中，参见图6，步骤s20可以包括以下步骤：使用第一正向引物、第一反向引物和第二反向引物对待测核酸样本进行第一轮pcr扩增，得到第一轮pcr扩增产物（步骤s201）；使用第二正向引物和第三反向引物对第一轮pcr扩增产物进行第二轮pcr扩增，得到第二次pcr扩增产物（步骤s202）。
103.在一些示例中，在每一轮pcr扩增后还包括对扩增产物进行磁珠纯化的步骤。换言之，在第一轮pcr扩增后还包括对第一轮pcr扩增产物进行磁珠纯化的步骤，在第二轮pcr扩增后还包括对第二轮pcr扩增产物进行磁珠纯化的步骤。参见图7，步骤s20可以包括以下步骤：使用第一正向引物、第一反向引物和第二反向引物对待测核酸样本进行第一轮pcr扩增，得到第一轮pcr扩增产物（步骤s21）；对第一轮pcr扩增产物进行磁珠纯化（步骤s23）；使用第二正向引物和第三反向引物对第一轮pcr扩增产物进行第二轮pcr扩增，得到第二次pcr扩增产物（步骤s25）；对第二次pcr扩增产物进行磁珠纯化，得到目标文库（步骤s27）。
104.在一些示例中，使用第一正向引物、第一反向引物和第二反向引物对待测核酸样本进行第一轮pcr扩增得到的第一轮pcr扩增产物保存于试管并封闭，然后，将试管中的第一轮pcr扩增产物进行磁珠纯化的步骤（步骤s23）。在这种情况下，通过磁珠法纯化能够将核酸提纯，并将所需长度的核酸片段保留，由此能够得到纯化后的pcr扩增产物。此外，在步骤s23的纯化过程中，需对保存有第一轮pcr扩增产物的试管进行开盖操作，但由于扩增后的核酸的含量较高，此时开盖较容易产生气溶胶且气溶胶扩散至实验室环境中，从而产生气溶胶污染。在这种情况下，由于对待测核酸样本进行第一轮pcr扩增后，已通过使第二反向引物带有的第一条形码对不同的待测核酸样本进行标记，即使产生气溶胶，也能够减少气溶胶污染等对不同样本之间的检测结果的影响。
105.在一些示例中，使用第二正向引物和第三反向引物对混合扩增产物进行pcr扩增，然后，进行磁珠纯化的步骤（步骤s27），以得到目标文库。在这种情况下，通过磁珠法纯化能够将核酸提纯，使核酸与蛋白等其他成分分离，并将所需长度的核酸片段保留，由此能够得到纯化后的目标文库。同样地，在纯化过程中，通常需进行开盖操作，由于扩增后的核酸的含量较高，此时较容易产生气溶胶且气溶胶扩散至实验室环境中，从而产生气溶胶污染。在
这种情况下，由于通过第二反向引物带有的第一条形码对不同的待测核酸样本进行标记，通过第二正向引物带有的第二条形码对不同批次的样本进行标记，由此也能够减少气溶胶污染等对不同批次间样本的检测结果的影响。
106.在一些示例中，在步骤s23、步骤s25和步骤s27的过程中，可以包括向样本添加实验试剂、收集或转移纯化后样本等操作。在上述操作过程中，有可能会存在人为失误导致的弄混样本、样本溅出、试剂被污染等问题，这些都可能引起样本间的污染。在这种情况下，即使存在前述的污染问题，由于每个待测核酸样本在利用第二反向引物进行扩增后（步骤s21后），每个待测核酸样本已分别被“贴上”不同的第一条形码，因此，也能够减少前述的污染问题对检测结果的影响。
107.在一些示例中，在步骤s23中，可以将每个待测核酸样本的第一轮pcr扩增产物混合并得到混合扩增产物，再对混合扩增产物统一进行磁珠纯化。在另一些示例中，在步骤s23中，可以将每个待测核酸样本的第一轮pcr扩增产物进行磁珠纯化，然后将纯化后的第一轮pcr扩增产物进行混合，再统一进行第二轮pcr扩增。由此，能够节约试剂和人力成本。
108.结合参考图8，可以先使用第一正向引物、第一反向引物和第二反向引物对保存在不同试管内的待测核酸样本（例如待测核酸样本21、待测核酸样本22、待测核酸样本23）进行第一轮pcr扩增（其中，不同的待测核酸样本使用具有不同第一条形码的第二反向引物），得到第一轮pcr扩增产物（分别包括第一轮pcr扩增产物31、第一轮pcr扩增产物32、第一轮pcr扩增产物33）。然后，将每个待测核酸样本的第一轮扩增产物（包括第一轮pcr扩增产物31、第一轮pcr扩增产物32、第一轮pcr扩增产物33）混合并得到混合扩增产物34，再使用第二正向引物和第三反向引物对混合扩增产物34进行第二轮pcr扩增，以得到目标产物35。在这种情况下，通过对混合扩增产物统一进行磁珠纯化和/或统一进行第二轮pcr扩增，相较于对每个待测核酸样本的第一轮pcr扩增产物进行磁珠纯化及第二轮pcr扩增，能够减少试剂的使用和人力的成本。
109.在一些示例中，在步骤s20、步骤s201或步骤s21中，可以使用第一正向引物、第一反向引物和第二反向引物对待测核酸样本进行多重pcr扩增，得到pcr扩增产物。
110.在一些示例中，在步骤s201或步骤s21中，在使用第一正向引物、第一反向引物和第二反向引物对待测核酸样本进行第一轮pcr扩增时可以选择多个退火温度。例如可以从57℃~62℃中选取3个温度作为退火温度，例如选择57℃、60℃和62℃作为退火温度。由此，有利于使各个引物与模板结合，从而提高目标文库的覆盖度。
111.在一些示例中，在步骤s20、步骤s201或步骤s21中，也即在第一轮pcr扩增过程中，还可以添加人工质粒集合。在这种情况下，在第一轮pcr扩增中，人工质粒集合通过与第一正向引物和第一反向引物结合，能够对体系中的第一正向引物和第一反向引物进行消耗，由此，能够减少引物二聚体的形成；第一轮pcr扩增体系中的第二反向引物能够通过第一反向引物与人工质粒集合结合，由此，人工质粒集合也能够对第二反向引物进行消耗，减少引物二聚体的形成。也就是说，通过加入人工质粒集合能够减少第一轮pcr扩增过程中的引物二聚体的形成。可以理解地，由于人工质粒和靶标区域之间具有差异序列，在测序后进行序列比对时，能够将靶标区域产物和人工质粒产物区分开来。
112.在一些示例中，在第一轮pcr扩增或第二轮pcr扩增时，所使用的循环数可以根据检测灵敏度等的需求自行选择。优选地，在本实施方式中，每次pcr扩增时的循环数可以为
10~40个循环。由此，能够有助于满足病原体检测的灵敏度需求。
113.在一些示例中，如上所述，检测方法可以包括对目标文库进行测序分析，获得测序数据（步骤s30）。这里，目标文库是步骤s20中使用引物组或试剂盒对待测核酸样本进行pcr扩增所得到的。
114.在一些示例中，在步骤s30中，可以通过illumina测序平台对目标文库进行测序，以得到测序数据。当然，在另一些示例中，引物组的组成可以是其他测序平台的测序引物和测序接头，由此也可以使用其他测序平台对目标文库进行测序。
115.在一些示例中，测序数据可以包括目标文库的序列（即每条dna片段的序列）。换言之，测序数据可以包括每条reads的序列。在一些示例中，测序数据具体可以包括靶标区域的序列、第一条形码的序列和/或第二条形码的序列。
116.在一些示例中，如上所述，检测方法可以包括基于测序数据得到检测结果（步骤s40）。
117.在一些示例中，可以基于每条reads的序列判断该条reads是否为某个靶标区域的序列，也即判断各个靶标区域是否被检出。在一些示例中，可以基于第一条形码的序列识别检出的reads属于哪个样本，也可以基于第二条形码的序列识别检出的reads属于哪个批次的样本，从而得到该reads所属的批次和样本信息。由此，能够基于测序数据判断每个待测核酸样本中的各个靶标区域的检出情况。
118.在一些示例中，进一步地，可以基于各个靶标区域的阳性质控品与阴性质控品获取各个靶标区域的检出阈值，并基于检出阈值判断各个靶标区域是否被检出。在一些示例中，进一步地，可以利用阳性质控品与阴性质控品获取得到接受者操作特征曲线（receiver operating characteristic curve，roc曲线），并通过roc曲线建立每个靶标区域的检出阈值，然后根据检出阈值来判断待测核酸样本中每个靶标区域的检出情况。
119.在一些示例中，在步骤s40中，可以包括基于靶标区域的检出情况，判定待测核酸样本是否含有病原体。
120.在一些示例中，对于各个待测核酸样本，若被检出的靶标区域的数量与设计引物组时所选取的靶标区域的数量的比值大于预设比例，则判定该待测核酸样本中含有某病原体。
121.在一些示例中，对于各个待测核酸样本，若被检出的靶标区域的数量与设计引物组时所选取的靶标区域的数量相比不大于预设比例，则判定该待测核酸样本中不含某病原体。可以理解地，若某个待测样本含有某病原体，则理论上该样本中的该病原体的每个靶标区域均应被检出，因此若检测到该样本中只有小部分（未超过预设比例）的靶标区域被检出，则该样本可能是受到其他样本的污染。另外，若某个待测样本不含有某病原体，则理论上该样本中的该病原体的每个靶标区域均应不被检出，因此若检测到该样本中有靶标区域被检出（但未超过预设比例），则该样本可能是受到其他样本的污染。由此，可以根据被检出的靶标区域的数量与设计引物组时所选取的靶标区域的数量的比例和预设比例的关系，来进一步排除污染对检测结果的影响。
122.在本实施方式中，每个病原体的基因分别都选取了3个靶标区域，并对3个靶标区域进行检测。举例来说，若根据测序数据判断得到某病原体基因中有2个靶标区域被检出，则被检出的靶标区域的数量与靶标区域的总数的比值为2/3。然后，将该比值（2/3）与预设
比例进行大小比较，若该比值大于预设比例，则判定该待测核酸样本中含有该病原体，通常情况下，也可以称该待测核酸样本的检测结果为该病原体阳性；若该比值不大于预设比例，则判定该待测核酸样本中不含有该病原体，通常情况下，也可以称该待测核酸样本的检测结果为该病原体阴性。
123.在一些示例中，进一步地，预设比例可以为50%至80%。例如，若预设比例为50%，若在设计引物时对某个病原体的基因选取了3个靶标区域，则在判定待测核酸样本是否含有该该病原体时，需看是否有至少2个（2个或3个）靶标区域被检出。也就是说，一半以上的靶标区域被检出，则判定该待测核酸样本含有该病原体（即检测结果为阳性）。
124.以下，结合实施例来对本发明提供的检测呼吸道感染相关的病原体的引物组、试剂盒、应用和方法进行详细的说明，但是不应把它们理解为对本发明保护范围的限定。
125.[实施例]1、引物设计在实施例中，针对上表1至表15中的所有病原体进行设计引物。通过ncbi（www.ncbi.nlm.nih.gov）下载病原体的核酸序列，使用软件（clone manager）查找病原的保守序列区域。从每个病原体的保守序列区域选取3个区域作为靶标区域，并针对每个靶标区域设计特异性的正向互补序列和反向互补序列。具体序列信息如上表1至表15的seq id no.1~ seq id no.348所示。
[0126]
在实施例中，每个病原体的每个区域的第一正向引物从其5’端到3’端分别为第一测序引物和表1至表15中对应的上游引物，每个病原体的每个区域的第一反向引物从其3’端到5’端分别为表1至表15中对应的下游引物和第二测序引物。
[0127]
在实施例中，每个病原体的每个区域的第二反向引物、第二正向引物和第三反向引物为通用引物。第二反向引物从其3’端到5’端分别为第二测序引物、第一条形码和测序接头p7，第二正向引物从其5’端到3’端分别为测序接头p5、第二条形码和第一测序引物，第三反向引物为测序接头p7。
[0128]
在实施例中，第一条形码为碱基数为8的随机序列，针对同一个样本使用相同的第一条形码。第二条形码为碱基数为8的随机序列。
[0129]
在实施例中，测序接头p5和测序接头p7为illumina测序平台的通用接头序列；第一测序引物和第二测序引物为illumina测序平台的通用测序引物，具体序列如下：测序接头p5：aatgatacggcgaccaccgagatctacac（seq id:no.349）；测序接头p7：caagcagaagacggcatacgagat（seq id:no.350）；第一测序引物：acactctttccctacacgacgctcttccgat（seq id:no.351）；第二测序引物：gtgactggagttcagacgtgtgctctt（seq id:no.352）。
[0130]
2、样本提取收集7份口咽拭子样本并分别进行提取。具体而言，使用dna/rna共提试剂盒，参照试剂盒说明书进行操作。将分别所提取的7份待测核酸样本分别保存在试管，在-20℃下进行保存。上述dna/rna共提取试剂盒为市售试剂盒。
[0131]
7份待测核酸样本已使用赛默飞呼吸道微流体芯片进行验证，具体样本信息如下表16所示：表16 样本信息：
3、文库构建3.1 反转录将所提取的核酸分别用随机引物先进行反转录。具体而言，在八连管中加入2μl随机引物（25ng/
µ
l）和6μl提取得到的核酸，在65℃温育变性5min（分钟）后，冰上放置2min。接着，加入10μl的2
×
rt mix和2μl的hiscript ii enzyme mix。然后，进行反转录程序，反应条件为25℃，5min；50℃，45min；85℃，2min。最后，将得到的反转录产物（cdna/dna模板）在4℃的条件下保存。在实施例中，如未特别指明，所使用的试剂和仪器均为市售产品。
[0132]
3.2 第一轮pcr扩增第一轮pcr反应体系主要分别对每个样本添加上述的第一测序引物、第二测序引物、第一条形码和测序接头p7，还加入人工质粒集合以减少引物二聚体。
[0133]
将样本的所有靶标区域的pcr捕获分成2份进行，以反转录产物cdna/dna为模板，每个样本配制2个单独的pcr反应体系。
[0134]
具体而言，在室温下解冻pcr扩增缓冲液（amplicon pcr buffer），解冻之后进行振荡并混匀离心。将扩增酶混合物（ampliconenzyme mix）离心。对于表1至表15中的各个病原体基因，将各个病原体基因的多个靶标区域的第一正向引物根据靶标区域分为两个第一正向引物混合池，分别为第一正向引物混合池1和第一正向引物混合池2。对于表1至表15中的各个病原体基因，将各个病原体基因的多个靶标区域的第一反向引物根据靶标区域分为两个第一反向引物混合池，分别为第一反向引物混合池1和第一反向引物混合池2。在本实施例中，第一正向引物混合池1和第一反向引物混合池1用于对每个病原体基因的3个靶标区域中的部分靶标区域进行pcr捕获与扩增；第一正向引物混合池2和第一反向引物混合池2用于对每个病原体基因的3个靶标区域中的剩余靶标区域进行pcr捕获与扩增。另外，准备第二反向引物和cdna/dna模板。将上述所准备的试剂置于冰盒上备用。
[0135]
接着，按照下表17和下表18所示的pcr反应体系分别配制得到每个样本的第一轮pcr反应体系1和第一轮pcr反应体系2。对于不同样本加入不同的第二反向引物，同一样本的两个pcr反应体系中加入相同的第二反向引物。按样本数先配置预混反应液，分装至0.2mlpcr管，然后再加入第二反向引物和cdna/dna模板。
[0136]
表17第一轮pcr反应体系1：
表18第一轮pcr反应体系2：然后，将pcr管置于pcr仪中，按照下表19所示的第一轮pcr反应程序进行运行，得到第一轮pcr扩增产物。
[0137]
表19 第一轮pcr反应程序：
3.3第一轮pcr扩增产物纯化在实施例中，在第一轮pcr扩增完成后，将以上第一轮pcr反应体系1和第一轮pcr反应体系2的反应液混合，获得50μl体积的混合溶液。接着，使用35μl 体积0.7
×
的xp磁珠对混合溶液纯化后，使用80%的乙醇进行漂洗，待磁珠晾干后，继续使用53μl洗脱液（1
×
te buffer）进行洗脱。重复以上步骤一次，使用20μl洗脱液（1
×
te buffer）进行洗脱，得到纯化后的第一轮pcr扩增产物。
[0138]
3.4第二轮pcr扩增第二轮pcr扩增主要添加测序接头p5和第二条形码，并将第一轮pcr扩增产物富集。
[0139]
具体按照下表20所示的反应体系配制得到第二轮pcr反应液。
[0140]
表20 第二轮pcr反应体系：然后，将pcr管置于pcr仪中，按照下表21所示的反应程序运行，得到第二轮pcr扩增产物。
[0141]
表21 第二轮pcr反应程序：
3.5第二轮pcr扩增产物纯化从第二轮pcr扩增产物取20μl，添加30μl的1
×
te buffer，然后使用35μl的0.7
×
的xp磁珠纯化一遍，再用80%乙醇进行漂洗。接着，使用20μl洗脱液（1
×
te buffer）进行洗脱，得到纯化后的第二轮pcr扩增产物，也即目标文库。
[0142]
4、文库定量参考qubit flurometer 4.0 说明书，对纯化后的第二轮pcr扩增产物（目标文库）进行准确定量。需满足建库上机质控要求不低于2ng/μl，否则为建库失败。文库浓度如下表22所示：表22 文库浓度：5、上机测序、测序数据分析使用illumina测序平台的pe150对目标文库进行上机测序，步骤严格按照供应商要求进行。对测序所得的数据进行低质量序列和接头序列过滤。然后，利用比对软件bwa将其比对到参考病原数据库上，通过分析不同扩增子的测序深度（reads）与检出阈值来判断病原体的检出reads数，同一个病原体中有50%以上的靶标区域被检出则视为该病原体检出，否则视为未检出。
[0143]
6、检测结果检测结果如下表23所示：表23 检测结果：
上述结果中，样本2、样本3、样本4和样本5的检测结果为双重阳性，表明通过使用本实施方式所涉及的引物组或试剂盒对待测核酸样本进行检测，具有多重验证的效果，能够提高检测的真实性。
[0144]
虽然以上结合附图和实施方式对本公开进行了具体说明，但是可以理解，上述说明不以任何形式限制本公开。本领域技术人员在不偏离本公开的实质精神和范围的情况下可以根据需要对本公开进行变形和变化，这些变形和变化均落入本公开的范围内。