肺癌相关多肽、复合物、药物组合物及用途的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及肺癌相关多肽、复合物、药物组合物及用途。本发明还涉及一组多肽库及其在治疗肺癌特别是非小细胞肺癌中的应用。

背景技术：

1、肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，已成为我国城市人口恶性肿瘤死亡原因的第1位。非小细胞型肺癌包括鳞状细胞癌(鳞癌)、腺癌和大细胞癌，与小细胞肺癌相比其癌细胞生长分裂较慢，扩散转移相对较晚。非小细胞肺癌约占所有肺癌的80％，约75％的患者发现时已处于中晚期，5年生存率很低。

2、由taas、tsas、癌基因或抑癌基因突变蛋白及多肽所组成的疫苗目前归类为肿瘤多肽疫苗。t细胞主要通过识别与主要组织相容性复合体(major histocompatibilitycomplex，mhc)分子结合呈递的抗原多肽。人工合成多肽能够直接与mhc i类分子相结合，不需要抗原呈递细胞(antigen-presenting cells，apc)的加工处理。肿瘤多肽疫苗大多是由肿瘤细胞裂解或人工合成的肿瘤抗原肽段，单独或辅以佐剂用于肿瘤患者，肿瘤抗原肽段进入体内，直接诱导体内细胞毒性t淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte，ctl)的应答，激发机体的特异性肿瘤免疫反应。

3、铜蓝蛋白(ceruloplasmin，cp)又称铁氧化酶，是一种含铜的α-2球蛋白，具有氧化酶活性。cp参与了人体内许多重要的生理活动，在调节氧化应激及铁稳态中起重要作用。cp作为一种急性期反应蛋白，在感染、创伤、冠心病患者及妊娠妇女中表达增加。在肿瘤中，cp被认为是潜在的致癌因子，其中在肺癌、卵巢癌、肝癌等多种肿瘤中异常表达，且可通过调节铁死亡、血管生成和影响肿瘤微环境而参与肿瘤生长及转移。

4、xiv型胶原蛋白(collagen type xiv alpha 1chain，col14a)是一种间质胶原蛋白，属于具有间断三螺旋(facit)的原纤维相关胶原蛋白家族。col14a1有助于间质细胞外基质的组装和重塑，部分地通过促进胶原分子间形成分子间桥接来做到。col14a1表达的变化已被确定为多种纤维化疾病(包括特发性肺纤维化和纤维化肾病)的潜在生物标志物。对肿瘤基质相关生物标志物的研究进一步揭示，col14a1是乳腺癌患者样本临床分期负相关的一组基因之一。

5、丝氨酸蛋白酶抑制剂e2(serpin peptidase inhibitor clade emember 2,serpin e2)，最初被鉴定为神经胶质源性连接蛋白。serpin e2是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族的一员，可以抑制凝血酶、尿激酶、纤溶酶和胰蛋白酶等蛋白酶活性。serpin e2由人染色体2q99q35上的serpine2基因编码，是一类可以分泌到细胞外基质的蛋白。serpine2作为外周基质蛋白，可通过调节细胞外基质的降解影响神经元迁移和卵泡闭锁等生理过程，还可参与肿瘤的侵袭和迁移及纤维化的发生和发展等病理过程。

6、血小板白细胞c激酶底物同源性样结构域蛋白家族a成员2(pleckstrin homologylike domain family a member 2，phlda2)又被称为tssc3基因，是一个母源性的印记基因，编码一种胞浆蛋白，具有与血小板同源的结构域。在人胎盘组织中被鉴定为父源印记基因，位于cd-kn1c/kcnq1ot1印记区域中。cdkn1c/kcnq1ot1印记区域位于人11号染色体。在哺乳动物中phlda2基因调控胎盘的分化和胚胎早期的生长发育。phlda2基因低表达会造成胎盘生长过度；而phlda2基因的过表达会导致胎盘发育迟缓。在人的脑瘤等恶性肿瘤中，phlda2基因通过下调表达，参与肿瘤的发生。

7、热休克蛋白(heat shock protein，hsp)是一类在生物进化中高度保守且广泛存在于原核及真核生物中的蛋白质。hsp根据同源程度和分子量大小可分为hsp110、hsp90、hsp70、hsp60、hsp40、小分子hsp和泛素等多个亚家族。热休克蛋白(heat shock protein，hsp)gp96属于hsp90亚家族的成员，该蛋白是细胞内质网上含量最丰富的热休克蛋白。热休克蛋白gp96蛋白具有多肽结合特性，在内质网内其能接受来自tap复合体的多肽片段，协助将其组装至mhc i类分子，递呈于细胞膜上。不同组织来源的热休克蛋白gp96能携带有其来源组织内特异性表达的多肽片段。

技术实现思路

1、本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，得到了多肽或者多肽组合。本发明人惊奇地发现，该多肽或多肽组合能够与gp96形成复合物，致敏dc细胞，激活t细胞，能够有效地治疗和/或预防肺癌特别是非小细胞肺癌。由此提供了下述发明：

2、本发明的一个方面涉及多肽或多肽组合，其选自seq id nos:1-7所示多肽中的任意一种或多种多肽。

3、本发明所述多肽的氨基酸序列如下面的表1所示。

4、表1

5、

6、在本发明的一些实施方式中，所述的多肽或多肽组合，其包含seq id nos:1-7所示的多肽；优选地，其由seq id nos:1-7所示的多肽组成(本发明中也称为多肽库)。

7、本发明的另一方面涉及gp96-多肽复合物，其中，所述多肽为一种或多种本发明所述的多肽。

8、在本发明的一些实施方式中，所述的gp96-多肽复合物，其中，gp96与多肽的质量比为(1：5)至(5：1)，优选为(1：2)至(2：1)或(1：1.5)至(1.5：1)，更优选为1：1；

9、优选地，所述gp96为重组的人gp96蛋白；优选地，所述gp96的序列如seq id no:26所示。

10、mddevdvdgtveedlgksregsrtddevvqreeeaiqldglnasqirelreksekfafqaevnrmmkliinslyknkeiflrelisnasdaldkirlisltdenalsgneeltvkikcdkeknllhvtdtgvgmtreelvknlgtiaksgtseflnkmteaqedgqstseligqfgvgfysaflvadkvivtskhnndtqhiwesdsnefsviadprgntlgrgttitlvlkeeasdyleldtiknlvkkysqfinfpiyvwssktetveepmeeeeaakeekeesddeaaveeeeeekkpktkkvektvwdwelmndikpiwqrpskeveedeykafyksfskesddpmayihftaegevtfksilfvptsaprglfdeygskksdyiklyvrrvfitddfhdmmpkylnfvkgvvdsddlplnvsretlqqhkllkvirkklvrktldmikkiaddkyndtfwkefgtniklgviedhsnrtrlakllrfqsshhptditsldqyvermkekqdkiyfmagssrkeaesspfverllkkgyeviyltepvdeyciqalpefdgkrfqnvakegvkfdesektkesreavekefepllnwmkdkalkdkiekavvsqrltespcalvasqygwsgnmerimkaqayqtgkdistnyyasqkktfeinprhplirdmlrrikededdktvldlavvlfetatlrsgyllpdtkaygdriermlrlslnidpdakveeepeeepeetaedttedteqdedeemdvgtdeeeetakestae(seq id no:26)

11、当所述多肽为多种例如采用前述的多肽库(seq id nos:1-7)时，一个gp96分子可以与相同或不同的多肽形成复合物，例如，gp96-多肽复合物中的多肽可以相同或不同。

12、将所述多肽与热休克蛋白gp96在体外以自然吸附或热击方式形成复合物。

13、分别化学合成本发明的多肽，优选按等质量比混合，用dmso配制成浓度20mg/ml的多肽溶液，将多肽与热休克蛋白gp96按照质量比1:1或1:10混合，用ph7.4 0.01mol/l pbs缓冲液溶解至总体积4ml，在20℃或4℃下放置30分钟，或于55℃热击10分钟，在室温冷却30分钟，最后用50kd超滤管洗去未结合的多肽，即得gp96-多肽复合物。

14、本发明中，gp96-多肽复合物也表示为gp96+多肽复合物。

15、本发明的再一方面涉及一种gp96-多肽复合物组合，其由至少两种本发明中任一项所述的gp96-多肽复合物组成；

16、优选地，所述gp96-多肽复合物组合由seq id nos:1-7所示多肽分别与gp96形成的7种gp96-多肽复合物组成；

17、优选地，按照其中多肽的质量计算，7种gp96-多肽复合物两两之间的质量比为(1：5)至(5：1)，优选为(1：2)至(2：1)或(1：1.5)至(1.5：1)，更优选为1：1。

18、本发明中，gp96-多肽库复合物也表示为gp96+多肽库复合物。

19、本发明的再一方面涉及一种致敏的dc细胞，其由本发明中任一项所述的gp96-多肽复合物或者本发明的gp96-多肽复合物组合处理dc细胞得到；

20、优选地，所述dc细胞为人dc细胞或小鼠dc细胞；

21、gp96-多肽复合物在dc细胞培养物中的浓度按照gp96蛋白的质量计算，为50μg/ml至200μg/ml；优选为80μg/ml至120μg/ml；更优选为100μg/ml。

22、在本发明的一些实施方式中，所述致敏的dc细胞，其通过如下步骤获得：

23、(1)分离人pbmc，按浓度为2～4x106/ml铺入培养瓶中，每瓶40ml，置于37℃、5％co2培养箱中；

24、(2)孵育2小时后，轻晃培养瓶，收集悬浮细胞用于培养t细胞，再用pbs洗瓶1～2次，加入dc培养液(1640培养基+20ng/ml il-4+50ng/ml gm-csf)40ml后继续置于37℃、5％co2培养箱中；

25、(3)第3天补加40ml/瓶dc培养基；

26、(4)第6天加入终浓度20ng/ml的tnf-α；

27、(5)第7～8天收集1×107dc，在6孔板中溶于1ml的dc培养液，加入50μg本发明的gp96-多肽复合物，置于37℃、5％co2培养箱中共刺激4h；

28、(6)收集dc于50ml离心管，用0.9％生理盐水洗涤2次，每次1500rpm/min 5min。

29、本发明的再一方面涉及一种活化的人t细胞，其由本发明的致敏的dc细胞与人t细胞共同培养得到；优选地，所述活化的人t细胞是活化的人细胞毒性t淋巴细胞(cytotoxict lymphocyte，tc细胞)；优选地，所述致敏的dc细胞为致敏的人dc细胞；优选地，致敏的人dc细胞与人t细胞的比例为1：10。

30、在本发明的一些实施方式中，所述致敏的dc细胞，其通过如下步骤获得：

31、按照1：10的比例，将致敏的dc连同培养基一起转入t细胞培养袋中(t细胞数量达到3×108)进行联合培养；

32、第14天左右收集不少于3×109的细胞，用生理盐水1500rpm/min离心洗涤3次，每次5min，得到活化的人t细胞。

33、本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明中任一项所述的多肽或多肽组合、本发明中任一项所述的gp96-多肽复合物、本发明的gp96-多肽复合物组合、本发明的致敏的dc细胞或者本发明的活化的ctl细胞，以及一种或多种药学上可接受的辅料。

34、本发明的再一方面涉及一种疫苗组合物，其包含本发明的致敏的dc细胞以及细胞培养基，

35、优选地，细胞培养基是无血清的rpmi 1640；

36、优选地，所述疫苗组合物为用于治疗或预防肺癌的疫苗组合物；

37、优选地，所述肺癌是非小细胞肺癌；

38、优选地，非小细胞肺癌是鳞癌、腺癌或大细胞癌；

39、优选地，所述肺癌是原发性肺癌或转移性肺癌。

40、本发明的药物(疫苗)活化的t细胞回输裸鼠后，可向裸鼠提供肿瘤特异性t细胞免疫，清除体内肿瘤细胞，以及原位移植的肿瘤细胞，从而达到治疗癌症的目的。本发明作为肿瘤治疗性疫苗(药物)或细胞疗法、细胞药物，预期能够有效帮助患者降低肿瘤载量，术后即时施治能有效防止转移和复发。

41、本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的多肽或其组合、本发明中任一项所述的gp96-多肽复合物、本发明的gp96-多肽复合物组合、本发明的致敏的dc细胞或者本发明的活化的ctl细胞在制备治疗或预防肺癌的药物中的用途；

42、优选地，所述肺癌是非小细胞肺癌；

43、优选地，非小细胞肺癌是鳞癌、腺癌或大细胞癌；

44、优选地，所述肺癌是原发性肺癌或转移性肺癌。

45、在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

46、如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如肺癌特别是非小细胞肺癌)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如肺癌特别是非小细胞肺癌)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。

47、本发明中，术语“致敏”是指对机体或细胞进行某种处理，其反应性有所增强，称为致敏。具体地，致敏是机体或细胞因接触抗原性物质而自动产生，或因接受抗体或具有免疫活性的淋巴细胞后被动产生的免疫反应性增高的状态。

48、发明的有益效果

49、本发明取得了如下技术效果中的一项或者多项：

50、(1)本发明的多肽与gp96形成的复合物或致敏的dc疫苗可以活化肿瘤特异性t细胞应答，有效杀伤肺癌细胞，显著抑制肺肿瘤生长。

51、(2)本发明的多肽可以体外化学合成获得，与重组的gp96形成复合物，解决了人胎盘来源的gp96复合物的来源限制的问题。

52、(3)本发明的上述多肽含有多个hla i类分子限制的表位，基本涵盖了人类主要的hla的分型，因此具有广谱性。新生抗原预测流程中最重要也是最核心的工作之一是确定hla i类基因的亚型，只有与之相匹配的肿瘤抗原表位才能被cd8+t细胞识别，进而杀死肿瘤细胞。中国人群中常见的hla-i类基因型主要为hla-a2、hla-a11、hla-a24和hla-a33，因此本发明覆盖了中国绝大部分的人群。在使用时，如果将全部多肽混合后作为多肽库用于治疗肺癌，能够避免鉴定基因型的复杂程序。