一株暹罗芽孢杆菌及其应用

本发明属于食品生物，涉及一株暹罗芽孢杆菌及其应用，具体涉及一种大酱中分离出的具有外肽酶活性的暹罗芽孢杆菌及其应用。

背景技术：

1、在发酵食品行业，氨基酸不仅能赋予发酵食品鲜、甜、苦、涩等多种味觉特征，同时还为发酵过程中的功能微生物生长代谢提供氮源，促进发酵作用，因此氨基酸含量水平是食品发酵工业中一个重要的指标(化学通报,1998,8:1-9)。

2、氨基酸水平通常以氨基酸态氮进行表征。氨基酸态氮，也称为氨基氮或氨态氮，是由发酵食品中的蛋白质经蛋白酶、内肽酶和外肽酶逐步分解而成的产物，不仅能大致上反映氨基酸总量的水平，而且也可以衡量原料的发酵程度、蛋白质的水解程度，同时，氨基酸态氮含量的高低直接影响发酵食品的质量等级和整体风味。部分不良厂商通过外加味精(谷氨酸钠)而提高发酵食品的鲜味和氨基酸态氮含量，但这将影响消费者健康，并具可以通过氨基酸含量的测定而检控到(食品与发酵工业,2018,44(4):198-203)。

3、在目前发酵食品生产过程中，氨基酸态氮含量以及风味物质仍然无法满足消费者的需求，在提质减害、零添加等消费要求下，如何在不外加氨基酸或味精来提高氨基酸态的前提下来提高酱油的氨基酸含量，是目前亟需解决的问题。

4、芽孢杆菌作为一种可生产蛋白酶的、潜在的安全菌株，本领域中一直致力于新菌株的筛选与挖掘。在专利cn112195125a中公开了一株特基拉芽孢杆菌，其可应用于酱油的制备中，但是其只能产蛋白酶，并未展示其外肽酶活性。在专利cn112961801a中公开了一株贝莱斯芽孢杆菌，其只能产蛋白酶和氨肽酶。因此，现有还缺乏性能更加优良的、并且具备多种酶活性的安全菌株。

技术实现思路

1、基于目前存在的问题，本发明对发酵食品中可天然具有外肽酶活性的微生物进行筛选、分离、鉴定和应用表征，可以构建发酵食品来源的外肽酶活性菌株资源库，为提高发酵食品中氨基酸含量提供有效手段，为发酵食品提质减害提供技术支持。

2、本技术所使用的暹罗芽孢杆菌已经被诸多研究证明是可用于食品、药品的制备中；例如专利cn112725114a中通过添加暹罗芽孢杆菌和产朊假丝酵母强化大曲，制备得到富含乙酸乙酯的浓香型白酒；在专利107734972a中通过接种暹罗芽孢杆菌和乳酸菌进行发酵奶的制备；在专利cn112795519a中利用暹罗芽孢杆菌进行发酵制备富含乙偶姻的食醋；文献中指出，暹罗芽孢杆菌是韩国大酱发酵过程中主要细菌群之一(jeong d w,kim h r,jung g,et al.bacterial community migration in the ripening of doenjang,atraditional korean fermented soybean food[j].journal of microbiology&biotechnology,2014,24(5).)。并且，发明人也对暹罗芽孢杆菌dl-rxl01做了安全性检测。根据现有的报道及结果均可表明，暹罗芽孢杆菌dl-rxl01是一株食品级的安全菌株，并有望发展成为益生菌株，在更多的领域发挥作用。

3、本发明通过下述技术方案实现：

4、本发明的第一个目的是提供一株分离自发酵食品的暹罗芽孢杆菌dl-rxl01，分类学命名为暹罗芽孢杆菌bacillus siamensis，已于2021年10月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号cgmcc no.23532，保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

5、在一种实施方式中，所述暹罗芽孢杆菌dl-rxl01具有如下性质：

6、(1)采集自辽宁省农家大酱中；

7、(2)可同时产蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶；

8、(3)抗生素敏感型；

9、(4)非溶血性；

10、(5)对胃肠道具有良好耐受性；

11、(6)具备良好的抗氧化性能。

12、本发明的第二个目的是提供含有所述暹罗芽孢杆菌dl-rxl01的微生物制剂。

13、在一种实施方式中，所述微生物制剂的制备方法为：

14、将暹罗芽孢杆菌dl-rxl01接种至含10ml lb培养基中，于200-250rpm、37℃振荡培养24h；然后以1％接种量转接至含50ml lb培养基的250ml三角瓶中，继续以200-250rpm、37℃振荡培养24h；最后以1％接种量转接至含750ml lb培养基的3l三角瓶中，于200-250rpm、37℃振荡培养24h；将所述菌液置于8000rpm离心10min后收集菌体，将贝莱斯芽孢杆菌菌体用质量分数为0.9％氯化钠水溶液稀释，制备成109cfu/ml的菌悬液，即为液体微生物制剂；将菌悬液离心、取沉淀，在无菌环境下依次加入缓冲液(生理盐水)和冷冻保护剂(15～20g/100ml的蔗糖溶液)，待细胞浓度不低于107cfu/ml时，真空冷冻干燥处理得到固体微生物菌剂。

15、本发明的第三个目的是提供一种同时生产蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的方法，所述方法是利用所述暹罗芽孢杆菌dl-rxl01、液体微生物制剂或固体微生物制剂发酵生产。

16、在一种实施方式中，将所述暹罗芽孢杆菌dl-rxl01活化后添加至lb培养基，在200～250rpm、35～40℃振荡培养。

17、本发明的第四个目的是提供所述暹罗芽孢杆菌dl-rxl01在制备发酵食品中的应用。

18、在一种实施方式中，所述食品包括小米醋、黄酒、酱油、豆瓣酱、发酵豆乳、腐乳和/或黄豆酱。

19、在一种实施方式中，在小米醋制备过程中，在糖化和酒精发酵结束后，按不少于105cfu/ml的比例接种入贝莱斯芽孢杆菌dl-bj01进行发酵，至总酸≥3.5。

20、在一种实施方式中，在黄酒制备过程中，在“添加酒曲糖化、酵母发酵”的步骤中按不少于102cfu/ml的比例接种入发酵体系中。

21、在一种实施方式中，酱油制备的过程中，在发酵前添加至发酵原料中105cfu/ml或105cfu/g的比例接种，进行发酵。

22、在一种实施方式中，在豆瓣酱的制备过程中，在辣椒胚和甜瓣子混合后，按106cfu/ml的比例接种入暹罗芽孢杆菌dl-rxl01，进行发酵。

23、在一种实施方式中，在豆乳发酵前向原料中添加糖和植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌等发酵菌株，并按102cfu/ml比例加入暹罗芽孢杆菌dl-rxl01进行发酵。

24、在一种实施方式中，在腐乳制备过程中，向毛坯中添加按104cfu/ml(g)的比例接种入暹罗芽孢杆菌dl-rxl01。

25、在一种实施方式中，在黄豆酱制备过程中的发酵步骤中按106cfu/ml的比例加入暹罗芽孢杆菌dl-rxl01。

26、本发明的第五个目的是提供一种提高发酵食品中游离氨基酸含量的方法，所述方法是将暹罗芽孢杆菌dl-rxl01或所述微生物制剂添加至发酵食品的制备中。

27、优选地，将暹罗芽孢杆菌dl-rxl01或所述微生物制剂添加至发酵食品的发酵阶段进行发酵。

28、在一种实施方式中，所述发酵食品包括小米醋、黄酒、酱油、豆瓣酱、发酵豆乳、腐乳和/或黄豆酱。

29、本发明具有以下的优点和有益效果：

30、本发明从大酱中筛选到一株暹罗芽孢杆菌dl-rxl01，此菌株具备良好的分泌蛋白酶和外肽酶能力，且经验证其是一株食品级的安全菌株。将所述暹罗芽孢杆菌dl-rxl01添加至发酵食品的发酵过程中，在不额外添加味精的前提下可以提高发酵食品风味，提高发酵食品的氨基酸(态氮)含量，有助于提高发酵食品品质。且菌株对于胃肠道环境有良好的耐受作用，是一株潜在的益生菌，具备广阔的发展前景。

31、生物材料保藏

32、本发明所提供的暹罗芽孢杆菌dl-rxl01，分类学命名为暹罗芽孢杆菌bacillussiamensis，已于2021年10月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23532，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。