一株丙酸睾丸素单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

1.本发明涉及食品安全免疫检测领域，尤其涉及一株丙酸睾丸素单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用。


背景技术：

2.丙酸睾丸素(testosterone propionate，tp)是一种甾类同化激素(anabolic steroids,ass)，主要作用在于促进男子性器官的形成及第二性征的发育和维持.此外还有蛋白同化作用、促进长骨骺端融合、刺激红细胞增生等作用。可以促进蛋白质合成代谢、兴奋骨髓造血功能，刺激血细胞的生成。睾酮、甲基睾酮和苯丙酸睾酮均属于甾类同化激素，均有促进蛋白质合成，促进骨骼生长及红细胞生成等作用。
3.近年来，甾类同化激素在畜牧业养殖中被经常使用。同化激素是由天然来源的雄性激素经结构改造而得到的半合成激素类药物。由于它可以促进细胞的生长和分化，使肌肉扩增，提高饲料转化率，因此被一些不法分子违规添加到食品动物的饲养过程。滥用同化激素会对人及动物健康、社会和生态环境造成直接及潜在的危害。因此，20世纪80年代以来许多国家或组织通过立法来限制或禁止在食用性动物养殖中使用同化激素。但是由于利益驱动，在世界范围内同化激素仍在被大量滥用。国外有关尿液、血液及组织中同化激素残留检测报道的文献较多，多集中在分析活体动物的尿液或屠宰现场采集的高浓度靶组织。我国于20世纪90年代起开始禁止将甾类同化激素用于促生长目的，并开始相关的监测工作。但目前在国内尚没有成熟的针对动物肌肉中甾类同化激素残留检测的确证方法。
4.因此，建立快速有效的检测丙酸睾丸素含量的方法具有重要意义及市场价值。目前，检测丙酸睾丸素含量多采用高效液相色谱方法检测，但该检测方法较为繁琐、复杂，检测限过高。为了维护广大消费者的利益，有必要建立一种针对tp的高效、快速的检测方法，而酶联免疫法(elisa)前处理简单，成本低，可实现大量样品的快速检测，且检测时对样本的纯度要求不高。因此，建立高效的免疫学检测方法很有必要，然而建立此方法的一个重要前提即需筛选出针对丙酸睾丸素的高特异性单克隆单体。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明提供了一株丙酸睾丸素单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该杂交瘤细胞株制备的抗体对丙酸睾丸素具有较好特异性和检测灵敏度，可以同时用来检测丙酸睾酮、睾酮、甲基睾酮和苯丙酸睾丸素，可以用来建立检测四种同化激素的免疫学检测方法。
6.本发明的技术方案如下：
7.本发明的第一个目的在于提供一种分泌丙酸睾丸素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株已于2022年03月03日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.45120，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
8.本发明的第二个目的在于提供所述的杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：
9.(1)制备丙酸睾丸素半抗原及丙酸睾丸素完全抗原，将获得的丙酸睾丸素完全抗原与弗氏佐剂进行乳化得到免疫原1，丙酸睾丸素完全抗原与不完全弗氏佐剂乳化得到免疫原2；
10.(2)将步骤(1)所得免疫原1对动物进行首次皮下免疫，并用免疫原2进行加强免疫；
11.(3)对经过步骤(2)免疫过程的动物进行尾部1mm-2mm采血，通过酶联免疫吸附测定(ic-elisa)筛选出所采的小鼠血清中效价最高，对丙酸睾丸素抑制最好的小鼠；
12.(4)对步骤(3)筛选出的动物进行冲刺免疫，冲刺免疫采用不含弗氏佐剂的丙酸睾丸素完全抗原；
13.(5)将步骤(4)冲刺免疫后的动物的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，得到所述分泌丙酸睾丸素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
14.在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述丙酸睾丸素半抗原的分子式为：
[0015][0016]
在本发明的一个实施例中，所述丙酸睾丸素完全抗原通过以下方法制备得到：将丙酸睾丸素半抗原、n-羟基琥珀酰亚胺及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解于有机溶剂中，搅拌反应，得到活化液，将活化液加入到偶联用蛋白溶液中进行反应，得到所述丙酸睾丸素完全抗原。
[0017]
在本发明的一种实施方式中，丙酸睾丸素半抗原、n-羟基琥珀酰亚胺及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:2:2。
[0018]
在本发明的一种实施方式中，所述偶联用蛋白选自牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白、人血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白或人工合成的多聚赖氨酸。
[0019]
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)、(4)中，所述首次皮下免疫与加强免疫之间间隔一个月，加强免疫之间间隔21天，加强免疫与冲刺免疫之间间隔18天-21天。
[0020]
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)、(4)中，所述首次皮下免疫的剂量为100μg/只，加强免疫剂量为50μg/只，冲刺免疫剂量为25μg/只。
[0021]
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，所述免疫过程，包含1次首次皮下免疫、至少3次加强免疫和1次冲刺免疫。
[0022]
在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中，将冲刺免疫后的balb/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，融合后的细胞通过hat培养基筛选培养，利用间接elisa检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争elisa法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，最终筛选出获得能分泌高灵敏度丙酸睾丸素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0023]
在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中，所述细胞融合是在冲刺免疫结束3天后
进行。
[0024]
在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中，所述细胞融合是通过聚乙二醇(peg4000)法进行的。
[0025]
在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中，所述培养基为rpmi-1640培养基。
[0026]
在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中，所述亚克隆次数至少3次。
[0027]
本发明的第三个目的在于提供所述杂交瘤细胞株在制备丙酸睾丸素单克隆抗体中的应用。
[0028]
在本发明的一种实施方式中，丙酸睾丸素单克隆抗体的制备方法为取动物，腹腔注射石蜡油，再腹腔注射保藏编号为cgmcc no.45120的杂交瘤细胞株，注射后收集腹水，将腹水纯化，将获得的单克隆抗体低温保存。
[0029]
在本发明的一种实施方式中，所述方法为取8-10周龄balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1ml，7天后每只小鼠腹腔注射1
×
106个细胞/ml保藏编号为cgmcc no.45120的杂交瘤细胞株，从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单克隆抗体置于-20℃保存。
[0030]
本发明的第四个目的在于提供一种丙酸睾丸素单克隆抗体，所述丙酸睾丸素单克隆抗体是由权利要求1中所述杂交瘤细胞株分泌获得。
[0031]
本发明的第五个目的在于提供所述的杂交瘤细胞株、所述的丙酸睾丸素单克隆抗体在检测丙酸睾酮、睾酮、甲基睾酮和苯丙酸睾丸素中的一种或多种中的应用。
[0032]
本发明的第六个目的在于提供一种组合物，所述组合物包含所述的杂交瘤细胞株和/或所述的丙酸睾丸素单克隆抗体。
[0033]
本发明的第七个目的在于提供一种试剂盒，所述试剂盒中含有所述的杂交瘤细胞株、所述的丙酸睾丸素单克隆抗体和所述的组合物中的一种或多种。
[0034]
本发明的第八个目的在于提供所述的组合物、所述的试剂盒在检测丙酸睾酮、睾酮、甲基睾酮和苯丙酸睾丸素中的一种或多种中的应用。
[0035]
本发明所述杂交瘤细胞株分类命名单克隆细胞株。
[0036]
本发明的技术方案具有以下优点：
[0037]
本发明提供的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，对丙酸睾丸素具有较好的特异性和检测灵敏度(ic
50
值为0.72ng/ml)，并且可以同时检测睾酮(ic
50
值为5.33ng/ml)，甲基睾酮(ic
50
值为12.71ng/ml)和苯丙酸睾酮(ic
50
值为7.80ng/ml)。可实现对鸡肉和猪肉中丙酸睾酮、睾酮、甲基睾酮和苯丙酸睾酮的同时检测，为食品中丙酸睾酮、睾酮、甲基睾酮和苯丙酸睾酮四种同化激素残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。
附图说明
[0038]
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
[0039]
图1为本发明实施例3中丙酸睾丸素单克隆抗体对丙酸睾酮的抑制标准曲线；
[0040]
图2为本发明实施例3中丙酸睾丸素单克隆抗体对睾酮的抑制标准曲线；
[0041]
图3为本发明实施例3中丙酸睾丸素单克隆抗体对甲基睾酮的抑制标准曲线；
[0042]
图4为本发明实施例3中丙酸睾丸素单克隆抗体对苯丙酸睾酮的抑制标准曲线。
具体实施方式
[0043]
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0044]
下述实施例中涉及的培养基如下：
[0045]
rpmi-1640培养基(mg/l)：l-精氨酸290、l-门冬酰胺50、l-门冬氨酸20、l-胱氨酸二盐酸盐65.15、l-谷氨酸20、甘氨酸10、l-组氨酸15、l-羟脯氨酸20、l-异亮氨酸50、l-亮氨酸50、l-赖氨酸盐酸盐40、l-甲硫氨酸15、l-苯丙氨酸15、l-脯氨酸20、l-丝氨酸30、l-苏氨酸20、l-色氨酸5、l-酪氨酸23.19、l-缬氨酸20、对氨基苯甲酸1、硝酸钙100、无水硫酸镁48.84、无水磷酸二氢钠676.13、氯化钾400、氯化钠6000、葡萄糖2000、还原谷胱甘肽1、酚红5、l-谷氨酰胺300、生物素0.2、d-泛酸钙0.25、叶酸1、i-肌醇35、烟酰胺1、氯化胆碱3、盐酸吡哆醇1、核黄素0.2、盐酸硫胺素1、维生素b120.005、碳酸氢钠2000。
[0046]
溶液的配置如下：
[0047]
碳酸盐缓冲液(cbs)：称取na2co
3 1.59g，nahco
3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800ml混匀，调ph值至9.6，加双蒸水定容至1000ml，4℃贮存备用。
[0048]
磷酸盐缓冲液(pbs)：8.00g nacl，0.2g kcl，0.2g kh2po4，2.9g na2hpo4·
12 h2o，溶于800ml纯水中，用naoh或hcl调ph到7.2-7.4，定容至1000ml。
[0049]
pbst：含0.05％吐温20的pbs。
[0050]
抗体稀释液：含0.1％明胶的pbs。
[0051]
tmb显色液：a液：na2hpo4·
12h2o 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000ml；b液：60mg tmb溶于100ml乙二醇中。a、b液按5：1混合即为tmb显色液，现用现混。
[0052]
下述实施例中涉及的检测方法如下：
[0053]
丙酸睾丸素抑制率检测方法：通过棋盘试验选择ic-elisa中最合适的抗原和抗体浓度。用碳酸盐缓冲液(cbs)将抗原稀释至0.01μg/ml，0.03μg/ml，0.1μg/ml和0.3μg/ml，并用抗体稀释液将抗体稀释至0.01μg/ml，0.03μg/ml，0.1μg/ml和0.3μg/ml。选择最佳工作点后，将丙酸睾丸素标准品稀释为8个浓度(0ng/ml，0.034ng/ml，0.103ng/ml，0.309ng/ml，0.926ng/ml，2.778ng/ml，8.333ng/ml和25ng/ml)，按照ic-elisa操作步骤，最后用originpro 8.5做图(结果如图1、图2、图3和图4所示)，获得丙酸睾丸素标准抑制曲线，计算ic
50
。
[0054]
本发明通过将丙酸睾丸素完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，hat选择性培养基培养，通过ic-elisa筛选细胞上清，最终得到了针对丙酸睾丸素具有高分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株。
[0055]
实施例1半抗原和完全抗原的合成
[0056]
由于丙酸睾丸素小分子不具有免疫原性，不能刺激小鼠产生免疫应答，进而产生抗体，因此需通过蛋白连接技术将丙酸睾丸素偶联到蛋白上，使其获得免疫原性；蛋白偶联技术中常用的活泼基团有氨基，羧基，羟基，巯基等，鉴于丙酸睾丸素分子结构式中不含有这些活泼基团，因此对丙酸睾丸素进行衍生。
[0057]
半抗原的衍生：由丙酸睾丸素肟化反应得到具有羧基的产物，即半抗原hapten tp，用碳二亚胺法将半抗原hapten tp与载体蛋白偶联，即得到丙酸睾丸素人工抗原；步骤为：
1640培养基在5％co2培养箱中培养。融合前要求sp
2/0
瘤细胞数量达到1-4
×
107，保证融合前sp
2/0
瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于rpmi-1640基础培养液中，进行细胞计数；
[0073]
c、融合过程7min：第1min，将1ml的peg 4000由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min和第4min，在1min内滴加1ml rpmi-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2ml rpmi-1640培养基；第7min，每10s滴加1ml的rpmi-1640培养基。然后37℃温浴5min。离心(800rpm，10min)，弃上清，细胞轻轻敲散，并向其内加入含20％胎牛血清，2％50
×
hat的rpmi-1640选择性培养基(hat培养基)，按照200μl/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5％co2培养箱中培养。
[0074]
3、细胞筛选与细胞株建立
[0075]
在细胞融合后的第3天用hat培养基对融合细胞进行半换液；第5天用含20％胎牛血清，1％的100
×
ht的rpmi-1640过渡培养液(ht培养基)进行全换液；第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-elisa法筛选出阳性细胞孔，第二步选用丙酸睾丸素为标准品，用ic-elisa法对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对丙酸睾丸素标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测。按上述方法进行三次亚克隆，最终获得丙酸睾丸素单克隆抗体细胞株4e1。
[0076]
实施例3丙酸睾丸素单克隆抗体的制备与鉴定
[0077]
取8周龄-10周龄balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1
×
106丙酸睾丸素杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除igg免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀igg型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01m pbs溶液(ph7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
[0078]
(1)包被：将包被原hapten tp-bsa用0.05m ph9.6碳酸盐缓冲液从1μg/ml开始3倍比稀释，100μl/孔，37℃反应2h。
[0079]
(2)洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min。
[0080]
(3)封闭：拍干后，加入200μl/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用。
[0081]
(4)加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μl/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1：3000稀释的hrp-羊抗鼠igg，100μl/孔，37℃反应30min。
[0082]
(5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μl的tmb显色液，37℃避光反应15min。
[0083]
(6)终止和测定：每孔加入50μl终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的od
450
值，绘制标准曲线，如图1、图2、图3和图4所示。
[0084]
用ic-elisa测定单克隆抗体丙酸睾酮的ic
50
为：0.72ng/ml；睾酮的ic
50
为：5.33ng/ml；甲基睾酮的ic
50
为：12.71ng/ml；苯丙酸睾丸素的ic
50
为：7.80ng/ml，说明对丙酸睾酮；睾酮、甲基睾酮和苯丙酸睾酮有很好的灵敏度，可用于丙酸睾酮、睾酮、甲基睾酮和苯丙酸睾酮四种同化激素免疫分析检测。
[0085]
实施例4丙酸睾丸素单克隆抗体的交叉反应率测定
[0086]
采用ic-elisa测定单克隆抗体对类似物(丙酸睾酮、睾酮、甲基睾酮和苯丙酸睾酮)的ic
50
值(具体ic
50
值如实施例3中所示)，再按以下公式计算其交叉反应率(cross-reactivity，cr)。
[0087]
计算公式：cr(％)＝ic
50
(目标物)/ic
50
(类似物)
×
100％
[0088]
单克隆抗体的交叉反应率通过测定与目标物结构类似物完成，交叉反应率检测结果如表1所示。由表1可以看出，丙酸睾丸素的单克隆抗体对丙酸睾丸素、睾酮、甲基睾酮和苯丙酸睾丸素都有交叉，交叉率在100％，13.51％，5.66％和9.23％。根据交叉反应率可以得出，该丙酸睾丸素单克隆抗体是一株群选性单克隆抗体，可以同时检测丙酸睾酮、睾酮、甲基睾酮和苯丙酸睾酮多种同化激素。
[0089]
表1单克隆抗体交叉反应率的测定
[0090][0091]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。