一种对高效裂解性噬藻体YongM数量定量的方法

本发明涉及对蓝藻噬藻体数量定量，更具体地说涉及一种对高效裂解性噬藻体yongm数量定量的方法。

背景技术：

1、噬藻体是一类特异性感染原核藻类的病毒群体。噬藻体是生态环境的组成因子，与宿主的生命活动密切相关，噬藻体在水体中能够调节微藻密度和群落结构。研究发现海洋噬藻体对聚球藻的日致死率为5％-14％。噬藻体的入侵还会改变宿主光合作用中心，使得光合作用发生率降低，间接影响水体初级生产力。此外，噬藻体还有助于微生物生态系统的营养循环和调节，因此可用作控制蓝藻的无害环境因子。

2、对于噬藻体数量的确定通常采用噬藻斑的方法，但该方法存在操作繁琐，出斑时间长，灵敏性差等缺点，不能很好反应噬藻体数量变化。

技术实现思路

1、本发明克服了现有技术中的不足，提供了一种对高效裂解性噬藻体yongm数量定量的方法，本发明通过提取噬藻体yongm的脱氧核糖核酸，利用qpcr技术与dna浓度对应建立标准曲线，进而快速、准确对裂解念珠藻的噬藻体yongm数量进行定量。

2、本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

3、一种对高效裂解性噬藻体yongm数量定量的方法，按照下述步骤进行：

4、(1)念珠藻nostoc sp.fachb-596的培养

5、取5ml念珠藻nostoc sp.fachb-596的藻液，以1∶100的体积比稀释至装有500mlbg11液体培养基的锥形瓶中，并置于温度为25℃，光照强度为2500lux，光暗周期为12：12h的光照培养箱中10天后，即得到生长对数期的吸光度为0.6的fachb-596藻液；

6、(2)噬藻体yongm的活化和扩大培养

7、制备浓缩藻液：取步骤(1)制备得到的生长对数期的吸光度为0.6的fachb-596藻液8000g离心10min后，保留相当于原体积1/20-1/40的上清液悬浮沉淀，即fachb-596浓缩藻液；

8、将含有噬藻体的感染液用bg11液体培养基做系列梯度稀释成10-1-10-6pfu/ml，取各稀释度的稀释液按体积比1∶3添加到3ml的fachb-596浓缩藻液中，混匀后，再转速70rpm、光照强度为2500lux、光暗周期为12：12h和25℃下孵育，使含有噬藻体的感染液中的病毒充分吸附到fachb-596藻细胞上，重复操作至含有噬藻体的感染液加入到fachb-596浓缩藻液中24小时内浓缩藻液发生明显黄化现象为止，即得到已黄化的藻液；

9、将上述已黄化的藻液12000g离心10min后，取上清液，即得到已活化的噬藻体yongm，取上述已活化的噬藻体yongm 50ml按照1∶10的比例添加到步骤(1)新鲜培养的生长对数期的fachb-596藻液中混匀，光照培养箱中培养24小时后上述藻液黄化，如此重复扩大培养，即得到噬藻体-藻共培养裂解液；

10、(3)噬藻体裂解液制备

11、取步骤(2)制备的噬藻体-藻共培养裂解液经12000g，4℃离心10min，取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤，即得到噬藻体yongm裂解液；

12、(4)噬藻体yongm dna的提取

13、取步骤(3)制备的噬藻体yongm裂解液经35000g，4℃离心150min，取沉淀并重悬即得到噬藻体浓缩液，取上述噬藻体浓缩液600μl加入3μl dnase i和3μl rnase a至dnase i和rnase a终浓度为1μg/ml，经37℃消化8h置后于80℃，灭活15min后，再向其中加入24μl0.5％edta，1.5μl 20μg/ml蛋白酶k，30μl 10％十二烷基硫酸钠，56℃水浴1h，以去除包裹脱氧核糖核酸的蛋白质外壳，再向其中加入与样品等体积的平衡酚溶液，温和振荡1min，经12000rpm离心10min，取上清液于新样品管中，再向上清液中加入与上清液等体积的酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)，温和振荡1min，经12000rpm离心10min，取上清液于新样品管中，再向其中加入400μl异丙醇，置于-20℃中3h，经4℃，13000rpm离心20min，缓慢移出上清液，再加入1ml 75％乙醇并置于-20℃预冷15min后，静置1min，经12000rpm离心10min，缓慢倒掉上清液，室温下静置至乙醇完全挥发，再加入30μl双蒸水溶解沉淀，即得到噬藻体dna，并置于-20℃保存；

14、(5)实时荧光定量pcr技术定量噬藻体yongm的数量

15、取步骤(4)所得的噬藻体dna，经超微量分光光度计测量所提取dna的浓度及纯度，再将噬藻体dna梯度稀释至50倍、25倍、10倍、5倍、1倍，取dna模板1μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，ddh2o 3μl，sybr qpcr master mix 5μl配置10μl qpcr体系，按下列条件进行qpcr反应：95℃10min进行预变性，95℃15s，60℃1min并重复40次进行循环反应，qpcr反应结束后，经95℃15s、60℃60s、95℃15s扩增溶解曲线检测扩增产物的单一性；

16、将浓度稀释至各倍数的噬藻体dna浓度与qpcr反应所得ct值进行对应，得标准曲线：lgx＝-0.3027ct+6.2367，相关度为0.986，其中，x为噬藻体dna浓度(单位为ng/μl)，ct为循环阈值(即每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数)。

17、噬藻体为一种环状dna病毒，yongm是以念珠藻fachb-596为靶标分离获得的噬藻体，yongm的宿主范围具有广谱性，除念珠藻外，还能感染、裂解多种微囊藻、色球藻、颤藻。

18、实时荧光定量技术为在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个pcr进程，最后通过标准曲线对未知浓度模板进行定量的方法，相比传统通过噬藻斑实验确定噬藻体数量的方法具有效率高可在短时间内处理大量样品、灵敏度高、量化范围广且重现性高的优点；所选引物序列为噬藻体yongm衣壳蛋白基因序列片段，具有强特异性，可防止其余物种dna干扰定量上游引物序列为tttggtttagacggtgctgc，下游引物序列为tcgggcaattgtcaaagctt。

19、本发明的有益效果为：本发明公开了一种对高效裂解性噬藻体yongm数量定量的方法，此方法与传统噬藻斑实验定量噬藻体数量相比，具有效率高可在短时间内处理大量样品、灵敏度高、量化范围广且重现性高的优点。

技术特征：

1.一种对高效裂解性噬藻体yongm数量定量的方法，其特征在于：按照下述步骤进行：

2.根据权利要求1所述的一种对高效裂解性噬藻体yongm数量定量的方法，其特征在于：噬藻体yongm是以念珠藻fachb-596为靶标分离获得的噬藻体。

3.根据权利要求2所述的一种对高效裂解性噬藻体yongm数量定量的方法，其特征在于：噬藻体yongm能够感染、裂解念珠藻、微囊藻、色球藻和颤藻。

4.根据权利要求1所述的一种对高效裂解性噬藻体yongm数量定量的方法，其特征在于：在实时荧光定量pcr技术中，所选引物序列为噬藻体yongm衣壳蛋白基因序列片段，其上游引物序列为tttggtttagacggtgctgc，其下游引物序列为tcgggcaattgtcaaagctt。

5.如权利要求1-4任一所述的一种对高效裂解性噬藻体yongm数量定量的方法在噬藻体yongm数量定量上的应用。

技术总结
本发明提供一种对高效裂解性噬藻体YongM数量定量的方法，包括下述步骤：念珠藻Nostoc sp.FACHB‑596的培养、噬藻体YongM的活化和扩大培养、噬藻体裂解液制备、噬藻体YongM DNA的提取和实时荧光定量PCR技术定量噬藻体YongM的数量。本发明通过提取噬藻体YongM的脱氧核糖核酸，利用qpcr技术与DNA浓度对应建立标准曲线，进而快速、准确对裂解念珠藻的噬藻体YongM数量进行定量。

技术研发人员：李子芃,童银栋,孙韬
受保护的技术使用者：天津大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/4