一种川芍2号SSR分子标记及其引物和应用

一种川芍2号ssr分子标记及其引物和应用
技术领域
1.本发明属于分子标记筛选技术领域，具体涉及一种川芍2号ssr分子标记及其引物和应用


背景技术：

2.白芍为芍药科(paeoniaceae)芍药属(paeonia l.)多年生草本植物芍药(paeonia lactiflor pall.)经去皮水煮加工后的干燥根。作为中国传统大宗中药材，白芍已被《中国药典》2020版收录，富含芍药苷、芍药内酯苷等主要有效成分，具有消炎保肝、降压镇痛、抗氧化、抗抑郁和免疫调节等功效，以及防治糖尿病并发症、增强认知能力和减弱学习障碍等多种作用。
3.白芍的道地产区为四川中江、安徽亳州、浙江磐安，也主产于山东菏泽，习称为川白芍、亳白芍、杭白芍、菏泽白芍。不同白芍种质在生产种植、药材产量与质量呈现不同程度的差异。其中，川白芍的芍药苷含量最高，素有“银心”白芍之称，是出口创汇的道地药材，主要来源于川芍1号与川芍2号，且川芍2号所产白芍的芍药苷含量高于川芍1号。川白芍种质只能通过芍头分株繁殖，繁殖系数低，种苗成本高。亳白芍质量比较好，且其种质——亳州芍药抗性好，可通过种子繁殖，种苗成本较低。随着各地大力发展中药材种植，主产地等不断扩大白芍种植面积，某些企业或种植户为了降低成本，常以价格低廉的白芍种质冒充优质白芍种苗，主产区四川中江、安徽亳州、浙江磐安、山东菏泽等地，盲目引种现象普遍，种质资源较为混杂，使得产出的药材在产量与质量上存在差异，影响了白芍种植业的发展。因此，有必要从种苗源头上规范白芍的种植生产。
4.不同白芍种质在形态上极其相似，传统的鉴定方法易受环境、植物生长发育阶段的限制，但其遗传物质有显著差异，可从基因水平上将各种质区分开。然而，白芍的基因组学研究还十分落后，国内外文献中只见到少量的rapd、issr、scot等遗传多样性及亲缘关系研究方面的报道，用于种质鉴定的特异分子标记极少，限制了白芍种质资源的合理利用及产业链的发展。
5.目前，川白芍种质—川芍2号的特异分子标记及其开发的有关报道罕见，尚未见利用ssr分子标记鉴别川芍2号的报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种川芍2号ssr分子标记，所述ssr分子标记为ssp2ch和/或ssp12ch；所述ssp2ch的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述ssp12ch的核苷酸序列如seq id no.2所示。
7.本发明还提供了一种扩增前述川芍2号ssr分子标记的引物对，所述扩增ssp2ch的引物的核苷酸序列如seq id no.3～4所示；所述扩增ssp12ch的引物的核苷酸序列如seq id no.5～6所示。
8.本发明还提供了一种检测权利要求1所述川芍2号ssr分子标记的试剂在制备鉴别
川芍2号的试剂盒中的用途。
9.进一步地，所述试剂包括扩增ssp2ch的引物，和/或ssp12ch的引物。
10.进一步地，所述扩增ssp2ch的引物的核苷酸序列如seq id no.3～4所示；所述扩增ssp12ch的引物的核苷酸序列如seq id no.5～6所示。
11.本发明还提供了一种用于鉴别川芍2号的试剂盒，它是检测ssr分子标记的试剂。
12.进一步地，所述ssr分子标记为ssp2ch和/或ssp12ch；所述ssp2ch的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述ssp12ch的核苷酸序列如seq id no.2所示。
13.进一步地，它是pcr检测试剂，包括扩增ssp2ch的引物，和/或ssp12ch的引物。
14.更进一步地，所述扩增ssp2ch的引物的核苷酸序列如seq id no.3～4所示；所述扩增ssp12ch的引物的核苷酸序列如seq id no.5～6所示。
15.本发明最后提供了一种鉴别川芍2号的的方法，它包括如下步骤：
16.(1)提取样本dna：取待检白芍，提取其中的dna；
17.(2)基因扩增：用前述的试剂盒对待检样本中的dna进行扩增；
18.(3)结果检测：用琼脂糖凝胶检测步骤2)所得扩增产物的片段大小。
19.进一步地，所述扩增产物的片段大小含300bp和/或217bp为川芍2号。
20.进一步地，所述待检白芍为川芍2号、川芍1号、亳州芍药、磐安芍药、菏泽芍药、安国芍药、绛县芍药、曲沃芍药和/或赤峰芍药。
21.本发明采用基因组测序ddrad-seq技术，利用自主开发设计的白芍ssr分子标记的引物扩增，根据琼脂糖凝胶电泳在300bp或217bp处有无特异扩增条带作为鉴定川芍2号的依据，可以检测单个或混合白芍种质dna样品；操作简单，结果准确，稳定性好，重复性高，灵敏度高，可检测低至3ng/μl的模板dna浓度，且不受操作人员差异的影响；可以将中江白芍(重瓣)中的“川芍2号”与“川芍1号”(重瓣)、浙江白芍(单瓣)、安徽白芍(单瓣)鉴别开。通过本发明能将植物形态和品质极相似的中江白芍(重瓣)中的“川芍1号”和“川芍2号”鉴别开，做到好中选好，优中选优，证明本发明ssr分子标记及其引物相对目前其他白芍分子鉴别技术更具针对性，鉴别结果更可靠。
22.本发明为川白芍种质来源的区分提供了一种快速、准确的鉴定手段，可广泛应用于川白芍选种育种、种植、采收储存、销售、应用等各个环节的种质鉴定，尤其是实现了白芍种苗的准确鉴定，这从种苗源头上保证了白芍质量。本发明为白芍产业链的发展提供了一种有效可靠的保证质量的方法，具备实际推广应用价值。
23.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
24.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
25.图1为9种供试材料分别与2个特异分子标记引物经pcr扩增后电泳检测的结果图。泳道m为dnamarker，泳道1～9分别为川芍2号、川芍1号、亳州芍药、磐安芍药、菏泽芍药、安国芍药、绛县芍药、曲沃芍药、赤峰芍药。图1-a为特异引物ssp2的扩增结果，图1-b为特异引
物ssp12的扩增结果。
26.图2为a、b不同测试人员对特异引物ssp2的pcr扩增结果。泳道m为dnamarker，泳道1～9分别为川芍2号、川芍1号、亳州芍药、磐安芍药、菏泽芍药、安国芍药、绛县芍药、曲沃芍药、赤峰芍药。
27.图3为a、b不同测试人员对特异引物ssp12的pcr扩增结果。泳道m为dnamarker，泳道1～9分别为川芍2号、川芍1号、亳州芍药、磐安芍药、菏泽芍药、安国芍药、绛县芍药、曲沃芍药、赤峰芍药。
28.图4为不同浓度的川芍2号经pcr法检测后鉴定的电泳图。图4-a为ssp2与川芍2号的pcr检测图，图4-b为ssp12与川芍2号的pcr检测图。泳道m为dnamarker，泳道l1的样品浓度为50ng/μl，泳道l2的样品浓度为25ng/μl，泳道l3的样品浓度为20ng/μl，泳道l4的样品浓度为15ng/μl，泳道l5的样品浓度为10ng/μl，泳道l6的样品浓度为5ng/μl，泳道l7的样品浓度为3ng/μl，泳道l8的样品浓度为0ng/μl。
29.图5为川芍2号特异分子标记—ssp2对白芍栽培种质纯度鉴定的扩增结果。泳道m为dnamarker，泳道1-10为川芍2号，泳道11-20为川芍1号，泳道21-29为亳州芍药，泳道30-37为磐安芍药，泳道38-47为菏泽芍药，泳道48-55为安国芍药，泳道56-59为绛县芍药，泳道60-63为曲沃芍药，泳道64-66为赤峰芍药，泳道67-69为银线绣红袍，泳道70-72为奇花露霜，泳道73-75为春晓，泳道76-78为大富贵，泳道79-81为蓝菊，泳道82-84为红绣球，泳道85-87为紫凤朝阳，泳道88-89为曹州红，ck为川芍2号。白色箭头表示川芍2号的特异条带。
30.图6为川芍2号特异分子标记—ssp12对白芍栽培种质纯度鉴定的扩增结果。泳道m为dnamarker，泳道1-10为川芍2号，泳道11-20为川芍1号，泳道21-29为亳州芍药，泳道30-37为磐安芍药，泳道38-47为菏泽芍药，泳道48-55为安国芍药，泳道56-59为绛县芍药，泳道60-63为曲沃芍药，泳道64-66为赤峰芍药，泳道67-69为银线绣红袍，泳道70-72为奇花露霜，泳道73-75为春晓，泳道76-78为大富贵，泳道79-81为蓝菊，泳道82-84为红绣球，泳道85-87为紫凤朝阳，泳道88-89为曹州红，ck为川芍2号。白色箭头表示川芍2号的特异条带。
具体实施方式
31.实施例1川芍2号ssr分子标记获得与应用
32.1、川芍2号ssr分子标记引物的获得
33.利用的简化基因组测序技术对白芍栽培种质—川芍1号、川芍2号、亳州芍药、磐安芍药、菏泽芍药进行测序，开发川芍2号特异分子标记。为了提高筛选特异性和有效性，我们在多态性ddrad标签中特异的ssr位点设计特异引物。测序由南京集思慧远生物科技有限公司完成，引物由擎科生物科技有限公司合成。
34.根据筛选得到的特异序列，设计特异引物：
35.(1)ssp2 f:5'-caaagggagaagggctacct-3'(seq id no.3)
36.r:5'-ttcccaatggaagttgaacag-3'(seq id no.4)
37.来源于序列ssp2ch：(seq id no.1)
38.caaagggagaagggctacctcccattgtgtagcccacttaatttcttaataataattataagttaaggggtctaatccccctttaactttattaaaaaaatggtcaaacaaattttttttcaaataatttttgatatgcttaacttgtatgtgatgctatatactgctttggatggttggtgtaatggcttgggttttcaggacccaaatttcactctgaaat
ttttgcattttaaaaaaaaaagaaagtcttgtgagtatcacagaatattcttgtgactgttcaacttccattgggaa
39.(2)ssp12
40.f:5'-tcacagagaacagagggaatga-3'(seq id no.5)
41.r:5'-gtcaaaaattgaggagccca-3'(seq id no.6)
42.来源于序列ssp12ch：(seq id no.2)
43.tcacagagaacagagggaatgagaaagagagagagagagagagagagagatagagagagagagagagagagagagtaggaggaggaggagcaaggcgacgcttactagggagaagagaagaaggcgaccagcgacaggggatgaacttgacggtggcatatctaggcgacgggggtggaggattcgatcagttttgatgggctcctcaatttttgac
44.2、川芍2号的pcr检测法
45.(1)以labgene plant dna isolation kit植物dna提取试剂盒提取供试样品—川芍2号、川芍1号、亳州芍药、磐安芍药、菏泽芍药、安国芍药、绛县芍药、曲沃芍药、赤峰芍药dna为模板，以1％琼脂糖凝胶电泳检测dna质量，以条带清晰无拖带为佳，稀释至50ng/μl，可作为后续pcr的优质模板。
46.(2)分别与特异引物ssp2、ssp12进行pcr扩增。
47.按照下述配制pcr反应体系：
[0048][0049]
将配制好的pcr反应体系放置与pcr仪中进行pcr扩增反应，反应程序设置为：
[0050]
98℃预变性3min；98℃变性10s，55～62℃退火10s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸2min。
[0051]
其中ssp2、ssp12的退火温度分别为：61.5℃、55℃。
[0052]
(3)pcr产物电泳检测：取pcr扩增产物5μl，使用3％琼脂糖凝胶在100v稳定电压下电泳检测。图1表明，ssp2、ssp12分别在300bp、217bp出现目的条带的为川芍2号样品，没出现目的条带的不是川芍2号样品。
[0053]
实施例2利用川芍2号ssr分子标记的引物鉴别川芍2号
[0054]
1、川芍2号的pcr检测法的稳定性研究
[0055]
从白芍栽培种质—川芍2号、川芍1号、亳州芍药、磐安芍药、菏泽芍药、安国芍药、绛县芍药、曲沃芍药、赤峰芍药这9种植物中提取基因组dna，以上述9种基因组dna为模板，分别与特异性引物ssp2、ssp12进行pcr扩增，pcr反应体系、扩增程序、检测方法同实施例1，以不同的操作人员进行重复扩增，以验证川芍2号的pcr检测法的稳定性。
[0056]
图2-图3结果表明，不同操作人员对同一特异性引物的pcr扩增结果相同。本发明提供的特异分子标记可以用于川芍2号的鉴定，方法操作简单，准确性高，稳定性强。
[0057]
2、川芍2号的pcr检测法的灵敏度研究
[0058]
将原始川芍2号的dna模板进行稀释，稀释为50、25、20、15、10、5、3、0ng/μl等8个浓度的dna溶液。
[0059]
分别以这8种不同浓度的川芍2号基因组dna作为模板(0.5μl)，以ssp2或ssp12为引物进行pcr扩增，pcr反应体系、扩增程序、检测方法同实施例1，以验证川芍2号pcr检测方法的灵敏度。
[0060]
图4显示，当川芍2号基因组dna模板浓度为3ng/μl，即含量仅为0.1ng时，在300bp或217bp处依然出现川芍2号的特异条带。本发明提供的ssr分子标记灵敏度高，含量微弱的白芍种质dna也能够检测出来。
[0061]
实施例3川芍2号ssr分子标记在白芍种质栽培资源纯度鉴定中的应用
[0062]
以labgene plant dna isolation kit植物dna提取试剂盒提取供试样品—川芍2号、川芍1号、亳州芍药、磐安芍药、菏泽芍药、安国芍药、绛县芍药、曲沃芍药、赤峰芍药、银线绣红袍、奇花露霜、春晓、大富贵、蓝菊、红绣球、紫凤朝阳、曹州红这17种植物的基因组dna，所选用群体大小为89株，以上述89份dna为模板，分别用特异性引物ssp2、ssp12进行pcr扩增，pcr反应体系、扩增程序、检测方法同实施例1，统计鉴别正确率。
[0063]
图5、图6显示，ssp2、ssp12的扩增结果中，仅川芍2号样品分别在300bp、217bp出现目的条带，其余样品没有此条带，其鉴定结果与田间鉴定结果完全一致(100％)。本发明开发的两个特异分子标记能够高效快速地鉴别川白芍新品种—川芍2号。
[0064]
综上，本发明利用自主开发设计的白芍种质ssr特异分子标记的引物扩增，根据琼脂糖凝胶电泳在300bp或217bp处有无特异扩增条带作为鉴定川芍2号的依据，可以检测单个或混合白芍种质dna样品；操作简单，结果准确，稳定性好，重复性高，灵敏度高，可检测低至3ng/μl的模板dna浓度，且不受操作人员差异的影响；可以将中江白芍(重瓣)中的“川芍2号”与“川芍1号”(重瓣)、浙江白芍(单瓣)、安徽白芍(单瓣)鉴别开。用于鉴别中江白芍(重瓣)中的“川芍1号”和“川芍2号”，更具针对性，结果更加可靠。