一种特异性识别甲萘威和/或1-萘酚的双特异性纳米抗体及其应用

本发明涉及生物检测，具体地，涉及一种抗甲萘威和/或1-萘酚的双特异性纳米抗体及其应用。

背景技术：

1、甲萘威(carbaryl)是氨基甲酸酯类杀虫剂中第一个大量生产的品种，对害虫有强烈的触杀作用，主要用于防治棉花、水稻及果树害虫。1-萘酚(1-naphthol)是甲萘威的主要代谢产物之一，是农药、染料、医药等方面的重要中间体，广泛应用于染料、香料和油脂的合成。

2、对农作物中残留的甲萘威及1-萘酚进行准确检测是避免甲萘威及1-萘酚对人畜健康造成损伤的重要手段。目前国家标准中，对于1-萘酚，尚未有明确具体国标最低限量，对于甲萘威的检测方法主要为仪器分析方法，如色谱与质谱联用的检测方法等。此类检测方法灵敏度和准确度高，但是需要昂贵的设备和试剂以及专业的操作人员，此外还需要经过复杂的制样过程，其耗费的时间和成本远远无法满足目前市场对大量农产品进行筛查的需要。

3、免疫分析方法近年来发展起来的一种基于抗体特异性识别抗原分子并通过信号分子释放出的信号强度反映待测物含量的分析方法。免疫分析方法的特点是能够特异性的识别一种或一类目标分析物，灵敏度高，相较仪器分析方法而言所需设备简单，对操作人员专业要求低，检测时间短，有的免疫分析方法甚至能够在几分钟内对待测样品进行半定量或定量分析。常用的免疫分析方法有酶联免疫分析法、侧流免疫分析法、荧光免疫分析法、电化学免疫分析法等。免疫分析方法成功的关键在于制备灵敏度高特异性强的抗体。由于抗体的本质是蛋白质，因此免疫分析法必须在温和的条件下(合适的浓度的盐离子溶液、接近37℃的环境、偏中性的ph值、低浓度的有机溶剂等)进行，且需要避免免疫制剂在保存和运输过程中失活，影响其检测活性。

4、纳米抗体是一种新型的抗体制剂。1993年比利时科学家在羊驼科动物身上发现了天然缺失轻链的重链抗体。后来人们通过基因工程技术表达出这种重链抗体的抗原结合区，这种单个结构域的重链抗体片段是目前人们通过基因工程手段制备出的具有抗原识别与结合能力的最小抗体片段，其分子量大小只有15kda左右，仅为传统抗体的十分之一左右，其尺寸处于纳米级别，故又称为“纳米抗体”。

5、在纳米抗体应用的过程中，人们发现了纳米抗体具有一些有别于传统抗体的性质，其中最典型的是纳米抗体能够在高温处理后以及在一定浓度的有机溶剂中仍保留着较高的抗原结合能力，这些性质可以使样品前处理过程得到一定简化。同时纳米抗体还可通过基因工程改造成双特异性或多特异性，实现一种抗体多功能化，且总分子量大小仅为30kda左右，在基因工程及免疫检测方面具有较大的发展潜力，使得免疫分析法更加能满足市场对快检的需求。双特异性纳米抗体因其分子量小，特异性强，构建体的表达水平、纯化的容易程度和溶解度与组成单体的相当甚至可能更优，且能同时保留两种不同纳米抗体的功能活性和优势等特点而备受人们关注，逐渐成为纳米抗体分子改造研究领域的热点之一。

6、现甲萘威纳米抗体已成功制备(中国农业大学)，1-萘酚纳米抗体也已成功制备(华南农业大学)，并通过检测比对多株同源抗体的活性得到含以上两种纳米抗体的最优单体序列质粒，对于1-萘酚的elisa方法，检测灵敏度目前最低为7.6ng/ml，基于1-萘酚未有国标最低检测限量，因此，其检测方法依然有进步空间。为了更好地监测甲萘威的残留及代谢情况，发明一种能准确地同时检测甲萘威及其主要代谢产物1-nap的检测技术至关重要。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种特异性识别甲萘威和/或1-萘酚的双特异性纳米抗体及其应用，本发明提供的双特异性纳米抗体可通过基因工程重组表达的方式进行大量制备，基因工程重组表达的方式是将编码该双特异性纳米抗体的基因，通过克隆至表达载体，以蛋白表达的形式进行该双特异性纳米抗体的大量制备，其优势之一也在于仅需表达一种抗体蛋白，减少耗材，简化整个表达、纯化流程。该双特异性纳米抗体为将双特异性纳米抗体经过原核生物表达后，以蛋白的形式进行免疫学检测分析。

2、本发明的第一个目的是提供一种特异性识别甲萘威和/或1-萘酚的双特异性纳米抗体。

3、本发明的第二个目的是提供一种特异性识别甲萘威和/或1-萘酚的双特异性纳米抗体的编码基因。

4、本发明的第三个目的是提供一种重组载体。

5、本发明的第四个目的是提供一种细胞。

6、本发明的第五个目的是提供所述的双特异性纳米抗体、所述的编码基因、所述的重组载体、所述的细胞在检测甲萘威和/或1-萘酚中的应用。

7、本发明的第六个目的是提供所述的双特异性纳米抗体、所述的编码基因、所述的重组载体、所述的细胞在制备检测甲萘威和/或1-萘酚的试剂盒中的应用。

8、本发明的第七个目的是提供一种检测甲萘威和/或1-萘酚的方法。

9、本发明的第八个目的是提供一种检测甲萘威和/或1-萘酚的试剂盒。

10、为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

11、本发明要求保护一种特异性识别甲萘威和/或1-萘酚的双特异性纳米抗体，其氨基酸序列如seq id no.1所示：

12、qlqlvesggglvqaggslrlscaas-grifssdg-pgwfrqapgkerefvaa-isrlggst-yyadsvkgrftisrdlakktaylqmnslkpedtavyyc-asrrpggsydytgdyay-wgqgtqvtvss-epktpkpqg-ggggs-evqlvqsgggsvqaggslrlscaas-gdtysrytntyc-mgwfrqapgteregvag-idrfgiat-yadsvkgrftisqdksentlylqmnglkpedtamyyc-aavrycsghirdakgprlggf-swgqgtlvtvss；

13、其中，框架区c-fr1的氨基酸如seq id no.2所示：

14、qlqlvesggglvqaggslrlscaas；

15、框架区c-fr2的氨基酸如seq id no.3所示：

16、pgwfrqapgkerefvaa；

17、框架区c-fr3的氨基酸如seq id no.4所示：

18、yyadsvkgrftisrdlakktaylqmnslkpedtavyyc；

19、框架区c-fr4及铰链区的氨基酸如seq id no.5所示：

20、wgqgtqvtvss-epktpkpqg；

21、互补决定区c-cdr1的氨基酸如seq id no.6所示：

22、grifssdg；

23、互补决定区c-cdr2的氨基酸如seq id no.7所示：

24、isrlggst；

25、互补决定区c-cdr3的氨基酸如seq id no.8所示：

26、asrrpggsydytgdyay；

27、短肽连接子g4s的氨基酸为：ggggs；

28、框架区n-fr1的氨基酸如seq id no.9所示：

29、evqlvqsgggsvqaggslrlscaas；

30、框架区n-fr2的氨基酸如seq id no.10所示：

31、mgwfrqapgteregvag；

32、框架区n-fr3的氨基酸如seq id no.11所示：

33、yadsvkgrftisqdksentlylqmnglkpedtamyyc；

34、框架区n-fr4的氨基酸如seq id no.12所示：

35、swgqgtlvtvss；

36、互补决定区n-cdr1的氨基酸如seq id no.13所示：

37、gdtysrytntyc；

38、互补决定区n-cdr2的氨基酸如seq id no.14所示：

39、idrfgiat；

40、互补决定区n-cdr3的氨基酸如seq id no.15所示：

41、aavrycsghirdakgprlggf。

42、本发明同时要求保护一种特异性识别甲萘威和/或1-萘酚的双特异性纳米抗体的编码基因，编码的氨基酸序列如seq id no.1所示。

43、优选地，核苷酸序列如seq id no.16所示：

44、cagttgcagctcgtggagtctgggggaggattggtgcaggctgggggctctctgagactctcctgtgcagcctctggacgcatcttcagtagcgatggcccgggctggttccgccaggctccagggaaggagcgtgagtttgtagcagccattagcaggcttggtggtagcacatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacctcgccaagaaaacggcgtatttgcagatgaacagcctgaaacctgaagacacggccgtttactactgtgcatcccggaggccgggtggtagttatgactacaccggggactatgcctactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctcagaacccaagacaccaaaaccacaaggcggtggcggcggctctgaggtgcagctggtgcagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcctgtgcagcctctggagacacctatagtagatacaccaatacctattgcatgggctggttccgccaggctccagggacggagcgcgagggggtcgcaggtatcgatagatttggtattgcaacatacgcggactccgtgaagggccgattcaccatttcccaagacaaatccgagaacactctgtatctgcaaatgaacggcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcggcggtccgttattgtagtggtcacatccgcgacgcgaaagggcccagacttgggggcttctcgtggggccaggggaccctggtcaccgtctcctca。

45、本发明还要求保护一种重组载体，含有所述的编码基因或表达所述双特异性纳米抗体。

46、优选地，所述载体为表达载体。

47、优选地，所述表达载体为pcomb3xss。

48、本发明还要求保护一种细胞，其特征在于，含有所述的重组载体。

49、优选地，所述细胞为大肠杆菌细胞。

50、所述的双特异性纳米抗体、所述的编码基因、所述的重组载体、所述的细胞在检测甲萘威和/或1-萘酚中的应用；

51、所述的双特异性纳米抗体、所述的编码基因、所述的重组载体、所述的细胞在制备检测甲萘威和/或1-萘酚的试剂盒中的应用，

52、也都属于本发明的保护范围。

53、进一步，本发明要求保护一种检测甲萘威和/或1-萘酚的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的双特异性纳米抗体。

54、优选地，所述方法为基于间接elisa的方法，以式(iii)所述甲萘威完全抗原和式(iv)所述1-萘酚完全抗原中的一种或两种作为检测抗原，以权利要求1所述双特异性纳米抗体作为检测抗体。

55、

56、以及，一种检测甲萘威和/或1-萘酚的试剂盒，含有所述的双特异性纳米抗体。

57、优选地，还含有式(iii)所述甲萘威完全抗原和式(iv)所述1-萘酚完全抗原中的一种或两种作为包被抗原，

58、

59、更优选地，所述试剂盒还含有甲萘威标准品、1-萘酚标准品、酶标抗体、显色剂和终止剂中的一种或几种。

60、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

61、本发明双特异性纳米抗体可以应用于甲萘威及其主要代谢产物1-萘酚残留的实际样品检测。该双特异性纳米抗体具有较高的热稳定性和有机耐受性等特性，一方面，连接之后可成功保留结合活性，实现一种抗体的多功能化，且操作简单、所耗时间较短；另一方面，双特异性纳米抗体的效果不亚于各单体进行相同elisa检测的灵敏度，甚至通过连接子的最佳选择结合低温控制可实现进一步提高灵敏度和降低检测限，其中lodcbr低至0.85ng/ml，lod1-nap低至0.38ng/ml。本发明制备双特异性纳米抗体的方法具有普遍适用性，可用于其他小分子物质纳米抗体的改造和制备，具有很高的应用价值。