递送核酸药物的多肽载体、治疗肿瘤的核酸药物及其制备方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种mmp2酶响应型递送核酸药物的多肽载体、治疗肿瘤的核酸药物及其制备方法。

背景技术：

1、肺癌是世界上最致命的癌症之一，其常规治疗，如化疗、放疗和手术切除等治疗效果有限并且有严重的副作用。目前，基因疗法已成为治疗癌症等具有挑战性疾病的创新和有力手段。研究表明mir-126-3p在治疗肺癌方面具有潜在的疗效。然而，由于micrornas(mirnas)的强负电荷阻碍了其在细胞膜的内化，并且生理环境中的快速的酶消化会阻碍mirnas传递到体内所需的位点。如何安全有效地将mirnas输送至胞浆并释放仍然是基因调控和治疗的主要挑战。目前，许多载体，包括病毒和非病毒载体，已经被开发用于递送核酸。然而，病毒载体具有负载能力低，炎症/免疫原性反应，难以在大规模的中制造等缺点。近年来，非病毒载体因其设计方便、细胞毒性低、具有智能化响应性等优点使其在基因传递的应用受到越来越多的关注。为了有效将mirnas递送到癌细胞中，药物必须克服三个运输障碍:(1)避免被免疫系统俘获并到达病灶，(2)被癌细胞有效吸收，(3)保护并释放治疗性核酸。故我们设计了一种包裹microrna的mmp2酶响应型仿生纳米粒子来改善核酸药物向靶部位的传递。

2、天然细胞膜伪装纳米粒子是一类新的仿生纳米粒子，简便的细胞膜工程化赋予纳米颗粒高度复杂的功能，它们同时具有细胞膜的独特功能和纳米材料合成的通用性，使包裹细胞膜的纳米颗粒具有显著的优势，如具有延长循环、特异性靶向和免疫逃逸等一系列优点。目前，根据不同的需要，包括肿瘤细胞、干细胞、血小板等的生物膜已在生物医学领域得到广泛地研究。红细胞是我们体内的氧气转运体，寿命约为4个月，并能投射出许多表面标记。由于定位在红细胞膜上的各种蛋白介导，如cd47，这些蛋白具有自我识别功能，可防止免疫细胞吞噬，从而延长了仿生纳米粒子的循环寿命。多肽类药物载体是重要的非病毒载体之一，而细胞膜穿透肽富含带正电的碱性氨基酸短肽，可在生理条件下能够与带负电的核酸药物通过静电相互作用自组装形成非共价结合的纳米粒。而癌细胞中过表达基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,mmp2)可特异性识别和切割肽序列pro-leu-gly-leu-ala-gly(plglag)。

3、基因治疗是癌症治疗的重要手段之一，但如何安全高效可行地将mirna递送至体内是目前研究中亟需解决的问题。目前，许多载体，包括病毒和非病毒载体，已经被开发用于递送核酸。然而，病毒载体具有负载能力低，炎症/免疫原性反应，难以在大规模的中制造等缺点。近年来，用于核酸递送的非病毒载体主要有有机聚合物、无机纳米颗粒等，虽然这些核酸递送载体被广泛研究，但其仍存在诸多缺点，例如有机聚合物递送靶向性差，无机纳米颗粒的生物可降解性差，容易在体内蓄积导致生物毒性等。

4、mmp2酶响应肽plglag可以用于构建环境响应的纳米颗粒，从而改善向肺癌细胞释放mirna。然而，plglag序列在运载中，其稳定性和生物靶向性的以及体内活性都不理想。

技术实现思路

1、基于此，本发明的目的是构建一种mmp2酶响应型的仿生纳米颗粒高效靶向递送mir-126-3p mimics的体系。

2、包括技术方案如下：

3、本发明的第一个方面，是提供一种递送核酸药物的多肽载体，其氨基酸构成如seqid no.3所示。

4、本发明的第二方面，是提供上述的多肽载体在递送microrna药物中的应用。

5、本发明的第二方面，是提供由红细胞膜包裹上述的多肽载体和靶向肿瘤的microrna药物形成的纳米粒制备而成。

6、在其中一些实施例中，所述肿瘤是mmp2酶响应型肿瘤。

7、在其中一些实施例中，所述肿瘤是肺癌。

8、在其中一些实施例中，所述microrna药物为mir-126-3p mimics。

9、本发明的第四个方面，是提供上述治疗肿瘤的核酸药物的制备方法，包括以下步骤：

10、(1)获得红细胞膜；

11、(2)将所述多肽载体溶解于pbs，得到多肽载体溶液；

12、(3)将靶向肿瘤的microrna药物溶解于无核酶水，得到microrna药物溶液；

13、(4)按照多肽载体与所述靶向肿瘤的microrna药物的质量比例为20-40：1的比例，将多肽载体溶液与核酸药物溶液混合均匀，室温静置，使核酸与多肽通过正负电自组装的方式形成纳米粒；

14、(5)在所得纳米粒中加入所述红细胞膜，混合均匀，将制得的纳米颗粒通过梯度挤压得到粒径均一的纳米粒，获得核酸药物。

15、在其中一些实施例中，所述多肽载体与所述靶向肿瘤的microrna药物的质量用量比例为20-40：1，优选为28-32：1。

16、在其中一些实施例中，所述红细胞膜与纳米粒的质量用量比为5:1～30:1，优选为8-12:1。

17、为了有效地将mirnas有效递送到癌细胞中，药物必须克服三个运输障碍:(1)避免被免疫系统俘获并到达病灶，(2)被癌细胞有效吸收，(3)保护并释放治疗性核酸。故本发明构建了一种mmp2酶响应型的仿生纳米颗粒高效靶向递送mir-126-3p mimics的体系。首先，在mmp2酶可切割肽plglag两端合成了6个精氨酸残基的阳离子肽:6r-plglag-6r。该阳离子肽可控地负载所述mirna，并可在环境响应的条件下，释放所述mirna，有利于疾病的治疗。其次，本申请发明人根据积累的经验，筛选到合适的制备参数，所述6r-plglag-6r通过静电吸附结合mir-126-3p mimics，进一步用红细胞膜进行修饰，获得的remain具有最小的粒径和最大转染效率，有利于纳米颗粒向肿瘤组织蓄积以及有利于mir-126-3p更好的递送。当mmp2酶响应的仿生纳米颗粒被肺癌细胞吸收后，在肺癌细胞中大量存在mmp2时，6r-plglag-6r可被mmp2切割分解，mir-126-3p mimics被释放，达到控释的目的，有效诱导癌细胞凋亡。然而，这类纳米颗粒用于肺癌基因药物的递送还未见报道。本发明探索和发展了一种具有巨大前景的肺癌治疗新策略。

技术特征：

1.一种递送核酸药物的多肽载体，其特征在于，其氨基酸构成如seq id no.3所示。

2.权利要求1所述的多肽载体在递送microrna药物中的应用。

3.一种治疗肿瘤的核酸药物，其特征在于，由红细胞膜包裹权利要求1所述的多肽载体和靶向肿瘤的microrna药物形成的纳米粒制备而成。

4.根据权利要求3所述的核酸药物，其特征在于，所述肿瘤是mmp2酶响应型肿瘤。

5.根据权利要求4所述的核酸药物，其特征在于，所述肿瘤是肺癌。

6.根据权利要求3所述的核酸药物，其特征在于，所述microrna药物为mir-126-3pmimics。

7.根据权利要求3所述的核酸药物，其特征在于，所述多肽载体与所述靶向肿瘤的microrna药物的质量用量比例为20-40：1，优选为28-32：1。

8.根据权利要求3-7任一项所述的核酸药物，其特征在于，所述红细胞膜与纳米粒的质量用量比为5:1～30:1，优选为8-12:1。

9.权利要求3所述治疗肿瘤的核酸药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述红细胞膜与纳米粒的质量用量比为5:1～30:1，优选为8～12:1。

技术总结
本发明涉及一种递送核酸药物的多肽载体，其氨基酸构成如SEQ ID NO.3所示。本发明还提供了上述多肽载体的应用以及相应的治疗肿瘤的核酸药物，以及其制备方法。本发明设计的所述MMP2酶响应肽能够有效地结合miRNAmimics，而RBCM赋予纳米颗粒隐身功能，从而提高循环寿命、免疫逃逸和生物安全性。当MMP2酶响应的仿生纳米颗粒被肺癌细胞吸收后，在肺癌细胞中大量存在MMP2时，miR‑126‑3p mimics被释放，有效诱导癌细胞凋亡。本发明公开的所述的治疗肿瘤的核酸药物提供了具有巨大应用前景的肺癌治疗新策略。

技术研发人员：梁璐,余细勇,岑慧裕,张灵敏,徐文艳
受保护的技术使用者：广州医科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12