一种辅助鉴定白菜耐热性的方法及其使用的A06-14144455位点

本发明属于生物，尤其涉及一种辅助鉴定白菜耐热性的方法及其使用的a06-14144455位点，a06-14144455位点为白菜基因组中seq id no:1自5’末端起第101位的核苷酸。

背景技术：

1、白菜原产我国，是我国种植面积最大、产量最高的蔬菜作物之一。“周年生产供应”已成为白菜产业发展的重大需求，然而白菜性喜冷凉，最适生长温度为15-20℃。当气温超过25℃时，往往表现出幼苗徒长、叶片易变黄、植株纤弱、病毒病严重、苦味、粗纤维含量增加，结球白菜抱球难等现象，这给春夏白菜生产带来极大困难。随着分子生物学和生物信息学的不断发展，发掘与分离不同来源的抗逆主效qtl、挖掘与耐热基因或qtl连锁的分子标记，并通过分子设计育种进行高效聚合，选育稳定、持久的抗逆品种，成为培育高抗优质大白菜品种的有效途径之一。

2、分子标记是在dna水平上对目标性状进行选择，具有高效、快速、不受环境影响等优点，可以在幼苗期进行选择，加快育种过程，当前已经开发了一系列与白菜耐热相关的分子标记。郑晓鹰等用同工酶及rapd和aflp分子标记技术鉴定了与大白菜耐热性相关的遗传标记，获得了9个与耐热性qtl紧密连锁的分子标记。于栓仓等应用352个标记位点的大白菜aflp和rapd图谱，采用复合区间作图法对控制大白菜耐热性的数量性状基因位点(qtl)进行定位，用苗期热害指数进行耐热性表型鉴定共检测到5个耐热性qtl位点。李停停首次利用srap分子标记的方法进行了大白菜耐热性状的分子标记研究，获得的标记和耐热基因之间的交换值为16.7％，说明两者之间连锁较紧密。

3、snp属于新一代分子标记，是指在染色体基因组水平上单个核苷酸的变异引起的dna序列多态性。与第一、二代分子标记不同，snp具有分布密度高、遗传稳定性好、二等位基因型等特点。不同物种全基因组的序列测定及比较表明，snp遗传分析或基因诊断时的重现性、准确性及稳定性都优于ssr。当前，snp分子标记在白菜耐热性筛选上鲜有报道，因此开发与白菜耐热相关的snp分子标记具有重要意义。

4、kasp(kompetitive allele specific pcr)即竞争性等位基因特异性pcr，是用于snp分型的常用方法，具有高稳定性、准确性和低成本的特点，已被广泛应用于高通量分子辅助育种和品种鉴定。

技术实现思路

1、本发明的目的是辅助鉴定待测白菜的耐热性。

2、本发明首先保护引物组。所述引物组可由上游引物a06-14144455-x、上游引物a06-14144455-y和下游引物a06-14144455-c组成；

3、所述上游引物a06-14144455-x可由荧光标签序列甲和seq id no:2自5’末端起第21至51位所示的dna片段组成；

4、所述上游引物a06-14144455-y可由荧光标签序列乙和seq id no:3自5’末端起第22至52位所示的dna片段组成；

5、所述下游引物a06-14144455-c的核苷酸序列如seq id no:4所示。

6、所述引物组中，荧光标签序列甲的核苷酸序列可如seq id no:2自5’末端起第1至20位所示。所述荧光标签序列乙的核苷酸序列可如seq id no:3自5’末端起第1至21位所示。

7、本发明还保护上述任一所述引物组的应用，可为如下b1)-b3)中的任一种：

8、b1)辅助鉴定待测白菜的耐热性；

9、b2)辅助筛选具有或疑似具有耐热性的白菜品种；

10、b3)白菜育种。

11、本发明还保护seq id no:1的dna片段1或seq id no:1自5’末端起第71-140位所示的dna片段2的应用，可为如下b1)-b4)中的任一种：

12、b1)辅助鉴定待测白菜的耐热性；

13、b2)辅助筛选具有或疑似具有耐热性的白菜品种；

14、b3)白菜育种。

15、b4)作为辅助鉴定待测白菜的耐热性的分子标记。

16、本发明还保护一种辅助鉴定白菜耐热性的方法，可包括如下步骤：检测待测白菜基于a06-14144455位点的基因型，然后进行如下判断：

17、如果待测白菜基于a06-14144455位点的基因型为tt纯合型或ct杂合型，则待测白菜具有或疑似具有耐热性；

18、如果待测白菜基于a06-14144455位点的基因型为cc纯合型，则待测白菜不具有或疑似不具有耐热性；

19、a06-14144455位点为白菜基因组中seq id no:1自5’末端起第101位的核苷酸。

20、上述方法中，所述检测待测白菜基于a06-14144455位点的基因型的步骤可如下：

21、(1)以待测白菜的基因组dna为模板，采用上述任一所述引物组进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；

22、(2)完成步骤(1)后，采用仪器检测pcr扩增产物的荧光信号，根据荧光信号的颜色获得待测白菜基于a06-14144455位点的基因型。

23、上述方法中，所述检测待测白菜基于a06-14144455位点的基因型的步骤可如下：

24、(1)以待测白菜的基因组dna为模板，采用上述任一所述引物组进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；

25、(2)取步骤(1)得到的pcr扩增产物，测序；

26、(3)根据步骤(2)得到的测序结果，获得待测白菜基于a06-14144455位点的基因型。

27、本发明还保护一种试剂盒。所述试剂盒包括检测待测白菜基于a06-14144455位点的基因型的物质；

28、a06-14144455位点可为白菜基因组中seq id no:1自5’末端起第101位的核苷酸。

29、所述试剂盒具体可由检测待测白菜基于a06-14144455位点的基因型的物质组成。

30、上述任一所述试剂盒中，所述检测待测白菜基于a06-14144455位点的基因型的物质可为上述任一所述引物组。

31、本发明还保护上述任一所述的试剂盒的应用，可为如下b1)-b3)中的任一种：

32、b1)辅助鉴定待测白菜的耐热性；

33、b2)辅助筛选具有或疑似具有耐热性的白菜品种；

34、b3)白菜育种。

35、以白菜自交系256为母本，白菜自交系255为父本进行杂交，得到杂交f1；之后将杂交f1进行自交，得到由154个f2代植株组成的f2代分离群体。根据154个f2代植株基于a06-14144455位点的基因型和耐热性鉴定结果，发现基于a06-14144455位点的基因型为tt纯合型的34个f2代植株中，32个f2代植株耐热，2个f2代植株热敏感，鉴定的正确率为94％；基于a06-14144455位点的基因型为cc纯合型的50个f2代植株中，40个f2代植株热敏感，10个f2代植株耐热，鉴定的正确率为80％；基于a06-14144455位点的基因型为ct杂合型的70个f2代植株中，61个f2代植株耐热，9个f2代植株热敏感，鉴定的正确率为87％。由此可见，利用a06-14144455位点的基因型可以辅助鉴定白菜耐热性且具有较高的准确率。本发明具有重要的应用价值。