增加环状DNA分子复制的方法与流程

本发明涉及共价闭合的环状重组dna分子，其包含复制起点和包含均聚区域的插入片段，其中均聚区域在复制方向上位于与复制起点至少500bp的距离处和/或其中包含均聚区域的插入片段被定向为使得插入片段的转录方向与复制起点的复制方向相同。本发明还涉及共价闭合的环状重组dna分子用于在发酵过程中增加产量和/或缩短发酵时间的用途。

背景技术：

1、在基因治疗和许多其它治疗相关的生物化学和生物技术应用中，用于治疗和诊断目的的核酸的使用是非常重要的。例如，近年来在基因治疗领域出现了快速的发展，并取得了有希望的成果。因此，核酸被认为是用于基因治疗和针对感染性和恶性疾病预防性和治疗性疫苗的重要工具。例如，将从肿瘤细胞扩增的信使rna转染到树突细胞中以诱导肿瘤免疫(boczkowski等人(2000)cancer research 60,1028-1034)。

2、治疗性核糖核酸(rna)分子代表着一类有希望的药物。基于rna的治疗剂包括编码用作疫苗的抗原的mrna分子(fotin-mleczek等人(2012)j.gene med.14(6)：428-439)。另外，可以设想使用rna分子进行替代疗法，例如，用于向患者提供丢失的蛋白质诸如生长因子或酶(karikó等人(2012)mol.ther.20(5)：948-953；kormann等人(2012)nat.biotechnol.29(2)：154-157)。此外，考虑了非编码免疫刺激rna分子(heidenreich等人，int j cancer.2014 dec 21.doi：10.1002/ijc.29402.)和其它非编码rna(如微rna和长非编码rna)的治疗用途(esteller(2011)nat.rev.genet.15(12)：861-74)。

3、基于rna的治疗剂显示出比dna细胞转染更优异的一些性质。如通常所知，dna分子的转染可能导致严重的问题。例如dna分子的应用具有dna整合到宿主基因组的风险。外源dna整合到宿主基因组中可能会影响宿主基因的表达，并可能触发致癌基因的表达或肿瘤抑制基因的破坏。此外，通过将外来dna整合到基因的编码区中，可以使宿主必需的该基因-和由此的该基因产物灭活。如果dna的整合发生在涉及调控细胞生长的基因中，则可能存在特别的危险。然而，即使一些风险与dna的应用有关，dna仍然是一个重要的工具。如果使用rna，特别是mrna代替dna，则不会发生这些风险。使用rna而不使用dna的优点在于，不需要在体内施用病毒来源的启动子元件，并且不会发生与基因组的整合。此外，rna不必跨越核的屏障。

4、在基因治疗方法中，通常使用dna，尽管rna在近来的发展中也是已知的。重要的是，在所有这些基因治疗方法中，无论使用dna、病毒rna或者mrna，mrna都起到编码蛋白的序列信息的信使作用。一般来说，rna被认为是不稳定的分子：rna酶无处不在，并众所周知地难以灭活。而且，rna在化学上也比dna更不稳定。因此，可能令人惊讶的是，真核细胞中mrna的“默认状态”以相对稳定性为特征，并且需要特定的信号来加速单个mrna的降解。这个发现的主要原因似乎是细胞内的mrna降解几乎完全由核酸外切酶催化。然而，真核mrna的末端通过特定的末端结构及其相关蛋白被保护而抵抗这些酶：在5'末端的m7gpppn帽子，通常在3'末端的多聚(a)序列。去除这两个末端修饰因此被认为是限制mrna降解的速度。尽管稳定元件已经在α-珠蛋白mrna的3'utr中进行了表征，但是影响真核mrna代谢回转(turnover)的rna序列通常通过加速去腺苷化作用起到降解的启动子的作用(meyer,s.,c.temme等人综述(2004),crit rev biochem mol biol 39(4):1 97-21 6.)。

5、为了制造基于核苷酸的治疗剂，需要有效生产质粒载体。然而，本发明人已经发现均聚序列破坏(deteriorate)复制过程，从而导致复制速度降低或者甚至中断复制过程。结果使得发酵生产包含均聚序列的质粒的产量与不含这种序列的质粒的产量相比降低。此外，发酵生产质粒期间，均聚序列通常至少部分地被删除。

6、因此，需要以高保真度有效地复制包含均聚序列的载体。

技术实现思路

1、解决这些问题的方法是提供共价闭合的环状重组dna分子，其中均聚序列在复制方向上不直接位于复制起点旁边，而是其中，在均聚序列与复制起点之间存在一定的距离。

2、因此，本发明涉及共价闭合的环状重组dna分子，其包含：

3、-复制起点，

4、-包含均聚区域的插入片段，

5、其中均聚区域在复制方向上位于与复制起点至少500bp的距离处。

6、本发明的另一方面涉及共价闭合的环状重组dna分子，其包含：

7、-复制起点，

8、-包含均聚区域的插入片段，

9、其中包含均聚区域的插入片段被定向为使得插入片段的转录方向与复制起点的复制方向相同。

10、与其中均聚区域在复制方向上位于与复制起点小于500bp的距离处的共价闭合的环状重组dna分子的产量相比，其中均聚区域在复制方向上位于与复制起点至少500bp的距离处的共价闭合的环状重组dna分子可以提高发酵生产中共价闭合的环状重组dna分子的产量。

11、此外，与其中包含均聚区域的插入片段被定向为使得插入片段的转录方向与复制起点的复制方向相反的共价闭合的环状重组dna分子的产量相比，其中包含均聚区域的插入片段被定向为使得插入片段的转录方向与复制起点的复制方向相同的共价闭合的环状重组dna分子提高了发酵生产中共价闭合的环状重组dna分子的产量。

12、共价闭合的环状重组dna分子可以是质粒、粘粒、细菌人工染色体(bac)、噬菌体、病毒载体或其杂交体。优选地，共价闭合的环状重组dna分子是质粒。

13、通常地，复制起点是细菌来源的。优选地，复制起点是高拷贝数起点。复制起点可以来源于pbr322质粒、puc质粒、pmb1质粒、cole1质粒、r6k质粒、p15a质粒、psc101质粒或f1噬菌粒。优选地，复制起点来源于puc质粒。

14、在一些实施方案中，共价闭合的环状重组dna分子还包含重链中的引发体组装位点(pas-bh)。

15、通常地，共价闭合的环状重组dna分子还包含选择标记物，例如抗生素抗性基因或蔗糖选择性标记物。

16、在优选的实施方案中，包含在共价闭合的环状重组dna分子的插入片段中的均聚区域包含多聚(a)序列和/或多聚(c)序列。在更优选的实施方案中，均聚区域包含多聚(c)序列。在甚至更优选的实施方案中，均聚区域包含多聚(c)和多聚(a)序列。优选地，多聚(a)序列包含约20至约400个腺苷核苷酸、更优选约60至约250个腺苷核苷酸的序列。优选地，多聚(c)序列包含约10至200个胞苷核苷酸、更优选约20至40个胞苷核苷酸的序列。在特别优选的实施方案中，均聚区域包含约60至约70个腺苷核苷酸的多聚(a)序列和约20至30个胞苷核苷酸的多聚(c)序列。

17、本发明的另一方面涉及其中均聚区域在复制方向上位于与复制起点至少500bp的距离处的共价闭合的环状重组dna分子用于使发酵生产中共价闭合的环状重组dna的产量与其中包含均聚区域的插入片段在复制方向上位于与复制起点小于500bp的距离处的共价闭合的环状重组dna分子的产量相比增加的用途。

18、本发明的再另一方面涉及其中包含均聚区域的插入片段被定向为使得插入片段的转录方向与复制起点的复制方向相同的共价闭合的环状重组dna分子用于使发酵生产中共价闭合的环状重组dna的产量与其中包含均聚区域的插入片段被定向为使得插入片段的转录方向与复制起点的复制方向相反的共价闭合的环状重组dna分子的产量相比增加。

19、与其中包含均聚区域的插入片段在复制方向上位于与复制起点小于500bp的距离处的共价闭合的环状重组dna分子的发酵时间相比，当使用其中均聚区域在复制方向上位于与复制起点至少500bp的距离处的闭合的环状重组dna分子时，可以缩短发酵时间。

20、与其中包含均聚区域的插入片段被定向为使得插入片段的转录方向与复制起点的复制方向相反的共价闭合的环状重组dna分子的发酵时间相比，当使用其中包含均聚区域的插入片段被定向为使得插入片段的转录方向与复制起点的复制方向相同的共价闭合的环状重组dna分子时，可以缩短发酵时间。

21、本发明的另一方面涉及用于发酵生产共价闭合的重组dna分子的方法，其包括以下步骤：

22、(a)提供包含根据本发明的共价闭合的环状重组dna分子的微生物；

23、(b)使步骤(a)的微生物发酵。

24、在具体的实施方案中，该方法还包括以下步骤：

25、(c)从步骤(b)的微生物中分离共价闭合的环状重组dna分子。

26、在特别优选的实施方案中，微生物是细菌，优选为大肠杆菌(e.coli)。在优选的实施方案中，微生物是含有共价闭合的环状重组温度诱导型高拷贝dna质粒的细菌(例如大肠杆菌)，并且步骤(b)包括以下步骤：

27、(i)在补料分批阶段的生长阶段期间，使含有共价闭合的环状重组温度诱导型高拷贝dna质粒的细菌在25℃至32℃范围内的温度下生长，其中在补料分批阶段期间以使得生长速率为μ＝0.05至0.3小时-1(hr-1)的速率供应底物，

28、(ii)通过将温度升高到36℃至45℃，在生长阶段后诱导产生所述dna质粒；和

29、(iii)在(ii)施加的温度下继续发酵以积累所述dna质粒。

30、在更具体的实施方案中，步骤(i)中施加的温度为约30℃，并且步骤(ii)中施加的温度为约42℃。

31、在上述方法中，与其中包含均聚区域的插入片段在复制方向上位于与复制起点小于500bp的距离处的共价闭合的环状重组dna分子的产量相比，其中均聚区域在复制方向上位于与复制起点至少500bp的距离处的共价闭合的环状重组dna分子的产量增加。

32、与其中包含均聚区域的插入片段被定向为使得插入片段的转录方向与复制起点的复制方向相反的共价闭合的环状重组dna分子的产量相比，其中包含均聚区域的插入片段被定向为使得插入片段的转录方向与复制起点的复制方向相同的共价闭合的环状重组dna分子的产量增加。此外，与其中包含均聚区域的插入片段被定向为使得插入片段的转录方向与复制起点的复制方向相反的共价闭合的环状重组dna分子的发酵时间相比，发酵时间缩短。

33、本发明进一步提供了在发酵生产过程中共价闭合的环状重组dna分子的序列保持稳定的方法。例如，均聚区域在发酵生产期间保持稳定。

34、本发明的另一个方面涉及提高共价闭合的环状重组dna分子的产量的方法，其包括以下步骤：

35、(a)提供共价闭合的环状重组dna分子，其具有

36、-复制起点，和

37、-包含均聚区域的插入片段，其中均聚区域在复制方向上位于与复制起点小于500bp的距离处；

38、(b)修饰(a)的共价闭合的环状重组dna分子以使得均聚区域在复制方向上位于与复制起点至少500bp的距离处。

39、本发明进一步提供了提高共价闭合的环状重组dna分子的产量的方法，其包括以下步骤：

40、(a)提供共价闭合的环状重组dna分子，其具有

41、-复制起点，和

42、-包含均聚区域的插入片段，其中包含均聚区域的插入片段被定向为使得插入片段的转录方向与复制起点的复制方向相反；

43、(b)修饰(a)的共价闭合的环状重组dna分子以使得包含均聚区域的插入片段被定向为使得插入片段的转录方向与复制起点的复制方向相同。

44、最后，本发明涉及根据本发明的共价闭合的环状重组dna分子在体外转录rna中的用途。