一种L-薄荷醇产量提高的酿酒酵母菌株

本发明涉及一种l-薄荷醇产量提高的酿酒酵母菌株，属于代谢工程。

背景技术：

1、l-薄荷醇(l-menthol)是一种环状单萜烯醇，无色或白色针状结晶，分子式为c10h20o，含有三个手性碳原子。在众多异构体中，l-薄荷醇由于其独特的薄荷风味和清凉特效，被广泛应用于食品药品以及日化品行业。目前l-薄荷醇的生产方法主要为植物提取和化学合成，植物提取法受天气、地理等自然条件的限制，不利于其在工业上的应用，化学合成步骤繁琐，副产物较多，分离提取困难。随着合成生物学的迅猛发展，在工程菌株中异源表达来源于植物的基因，让微生物法合成薄荷醇成为可能。微生物法不受自然条件制约，合成周期短，对环境污染小，经济效益高，适合大规模生产。

2、申请人在前期构建了一株重组酿酒酵母工程菌wmt4，首次实现了发酵法生产l-薄荷醇，利用廉价的发酵培养基培养4d左右，l-薄荷醇的发酵产量达到5.03mg/l。随后利用诱导型启动子表达法尼基焦磷酸合酶突变体基因erg20ww，构建的酿酒酵母工程菌wmt5，发酵产量达到8.56mg/l。利用诱导型启动子表达橙花二磷酸合酶npps，构建的酿酒酵母工程菌wmt6，发酵产量达到11.56mg/l；以酿酒酵母工程菌wmt4为出发菌株，利用诱导型启动子共表达erg20ww与npps基因，构建的酿酒酵母工程菌wmt7，发酵产量达到14.36mg/l。以酿酒酵母工程菌wmt7为出发菌株，利用诱导型启动子过表达l-薄荷醇代谢途径中的关键酶基因柠檬烯羟基化酶基因l3h，提高l3h酶的表达量，解除l-薄荷醇后续合成步骤的代谢通量限制瓶颈，构建得到的酵母酿酒酵母工程菌wmt8，发酵产量达到18.74mg/l；以酿酒酵母工程菌wmt7为出发菌株，利用诱导启动子过表达融合蛋白tlims-l3h基因，提高l-薄荷醇代谢途径的催化效率，构建得到的酵母酿酒酵母工程菌wmt9，l-薄荷醇的发酵产量达到30.14mg/l。但是实际上，菌株wmt9的柠檬烯产量可以达到327.78mg/l，而最终合成的l-薄荷醇产量仅有30.14mg/l，代谢中间产物的转化效率低。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明通过在tlims和idi、tlims和l3h的c端添加ridd-riad短肽进行酶组装，拉近两个酶之间的距离，提高薄荷醇的产量。

2、本发明的第一个目的是提供一种l-薄荷醇产量提高的酿酒酵母菌株，所述的酿酒酵母菌株是在柠檬烯合成酶tlims和异戊二烯二磷酸异构酶idi的c端分别添加ridd和riad短肽，或在柠檬烯合成酶tlims和柠檬烯羟基化酶l3h的c端分别添加ridd和riad短肽。

3、进一步地，所述的柠檬烯合成酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。本发明中的柠檬烯合成酶tlims为柠檬烯合成酶lims去除前56个氨基酸序列形成。

4、seq id no.1所示的序列：

5、merrsgnynpsrwdvnfiqsllsdykedkhviraselvtlvkmeleketdqirqleliddlqrmglsdhfqnefkeilssiyldhhyyknpfpkeerdlystslafrllrehgfqvaqevfdsfkneegefkeslsddtrgllqlyeasflltegettlesarefatkfleekvneggvdgdlltriaysldiplhwrikrpnapvwiewyrkrpdmnpvvlelaildlnivqaqfqeelkesfrwwrntgfveklpfardrlvecyfwntgiieprqhasarimmgkvnalitviddiydvygtleeleqftdlirrwdinsidqlpdymqlcflalnnfvddtsydvmkekgvnvipylrqswvdladkymvearwfygghkpsleeylenswqsisgpcmlthiffrvtdsftketvdslykyhdlvrwssfvlrladdlgtsveevsrgdvpkslqcymsdynaseaearkhvkwliaevwkkmnaervskdspfgkdfigcavdlgrmaqlmyhngdghgtqhpiihqqmtrtlfepfa。

6、进一步地，所述的异戊二烯二磷酸异构酶idi的氨基酸序列如seq id no.2所示。

7、seq id no.2所示的序列：

8、mtadnnsmphgavssyaklvqnqtpedileefpeiiplqqrpntrssetsndesgetcfsghdeeqiklmnencivldwddnaigagtkkvchlmeniekgllhrafsvfifneqgelllqqratekitfpdlwtntccshplciddelglkgklddkikgaitaavrkldhelgipedetktrgkfhflnrihymapsnepwgeheidyilfykinakenltvnpnvnevrdfkwvspndlktmfadpsykftpwfkiicenylfnwweqlddlsevendrqihrml。

9、进一步地，所述的柠檬烯羟基化酶l3h的氨基酸序列如seq id no.3所示。

10、seq id no.3所示的序列：

11、melqissaiiilvvtytislliikqwrkpkpqenlppgppklplighlhllwgklpqhalasvakqygpvahvqlgevfsvvlssreatkeamklvdpacadrfesigtkimwydnddiifspysvhwrqmrkicvsellsarnvrsfgfirqdevsrllghlrssaaageavdlteriatltcsiicraafgsvirdheelvelvkdalsmasgfeladmfpsskllnllcwnksklwrmrrrvdaileaiveehklkksgefggediidvlfrmqkdsqikvpittnaikafifdtfsagtetsstttlwvmaelmrnpevmakaqaevraalkgktdwdvddvqelkymksvvketmrmhppipliprscreecevngytipnkariminvwsmgrnplywekpetfwperfdqvsrdfmgndfefipfgagrricpglnfglanvevplaqllyhfdwklaegmnpsdmdmseaegltgirknnlllvptpydpss。

12、进一步地，所述的ridd的氨基酸序列如seq id no.4所示。

13、seq id no.4所示的序列：

14、lrecelyvqkhniqallkdsivqlctarperpmaflreyferlekeeak。

15、进一步地，所述的riad的氨基酸序列如seq id no.5所示。

16、seq id no.5所示的序列：

17、leqyanqladqiikeategc。

18、进一步地，所述的酿酒酵母菌株在柠檬烯合成酶tlims的c端添加ridd，在异戊二烯二磷酸异构酶idi的c端添加riad，或在柠檬烯合成酶tlims的c端添加riad，在异戊二烯二磷酸异构酶idi的c端添加ridd。

19、进一步地，所述的酿酒酵母菌株在柠檬烯合成酶tlims的c端添加ridd，在柠檬烯羟基化酶l3h的c端添加riad，或在柠檬烯合成酶tlims的c端添加riad，在柠檬烯羟基化酶l3h的c端添加ridd。

20、进一步地，所述的酿酒酵母的宿主为酿酒酵母工程菌wmt9。宿主的构建方法参见中国专利cn202011060996.7，一种l-薄荷醇产量提高的重组酵母菌。具体是以酵母菌为宿主，过表达内源mva合成途径中的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因idi和截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶基因thmg1，并异源表达截短的柠檬烯合成酶基因lis、柠檬烯羟基化酶基因l3h、细胞色素p450还原酶基因cpr、反式异胡椒醇脱氢酶基因ipdh、异薄荷二烯酮还原酶基因ipr、类固醇异构酶基因ksi、长叶薄荷酮还原酶基因pgr和薄荷醇还原酶基因mmr，并表达了法尼基焦磷酸合酶突变体基因erg20ww和橙花二磷酸合酶基因npps，并利用诱导启动子过表达融合蛋白tlis-l3h基因。

21、ridd是camp依赖性蛋白激酶(pkas)调节(r)亚基的对接和二聚(d/d)结构域的前44个n-末端残基，riad是起源于a激酶锚定蛋白(akaps)结构域的两亲螺旋，该结构域特异性结合ridd二聚体。

22、本发明的第二个目的是提供所述的酿酒酵母菌株在发酵生产l-薄荷醇中的应用。

23、本发明的有益效果是：

24、本发明tlims-idi系列菌株中，单独添加ridd短肽至酶c端的实验组相比于不添加短肽的对照组，薄荷醇产量变化不明显。在添加riad短肽后，菌株薄荷醇产量提高了11.62％，添加完整ridd-riad互作短肽后，菌株yldia产量相比菌株yli提高了32.73％，达40.01mg/l；tlims-l3h系列菌株中，添加ridd短肽后薄荷醇产量无明显变化，在添加riad短肽后，菌株薄荷醇产量提高了8.21％，同时添加ridd-riad互作短肽后，菌株薄荷醇产量提高了46.84％，达到44.26mg/l。