一种新的G蛋白偶联受体蛋白及其用途

一种新的g蛋白偶联受体蛋白及其用途
技术领域
1.本发明属于生物大分子技术领域，尤其涉及一种新的g蛋白偶联受体蛋白及其用途。


背景技术：

2.g蛋白偶联受体(g protein-coupled receptors，gpcrs)是一大类膜蛋白受体的统称。这类受体的共同点是其立体结构中都有七个跨膜α螺旋，且其肽链的c端和连接(从肽链n端数起)第5和第6个跨膜螺旋的胞内环(第三个胞内环)上都有g蛋白(鸟苷酸结合蛋白)的结合位点。目前为止，研究显示g蛋白偶联受体只见于真核生物之中，而且参与了很多细胞信号转导过程。在这些过程中，g蛋白偶联受体能结合细胞周围环境中的化学物质并激活细胞内的一系列信号通路，最终引起细胞状态的改变。已知的与g蛋白偶联受体结合的配体包括气味，费洛蒙，激素，神经递质，趋化因子等等。这些受体可以是小分子的糖类，脂质，多肽，也可以是蛋白质等生物大分子。一些特殊的g蛋白偶联受体也可以被非化学性的刺激源激活，例如在感光细胞中的视紫红质可以被光所激活。与g蛋白偶联受体相关的疾病为数众多，并且大约40％的现代药物都以g蛋白偶联受体作为靶点；然而，现有新的g蛋白偶联受体蛋白及其用途不能识别同源性相近的g蛋白偶联受体；同时，不能对g蛋白偶联受体的特异性配体的进行高效、准确的检测。
3.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
4.(1)现有新的g蛋白偶联受体蛋白及其用途不能识别同源性相近的g蛋白偶联受体。
5.(2)不能对g蛋白偶联受体的特异性配体的进行高效、准确的检测。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种新的g蛋白偶联受体蛋白及其用途。
7.本发明是这样实现的，一种新的g蛋白偶联受体蛋白及其用途包括：
8.步骤一，在g蛋白偶联受体的n-末端、c-末端或膜内环区3插入真核细胞蛋白，获得g蛋白偶联受体蛋白；
9.所述g蛋白偶联受体为腺苷a2a蛋白；
10.所述真核细胞蛋白选自apc蛋白片段或与该片段序列同源性大于90％的蛋白。
11.一种新的g蛋白偶联受体蛋白的用途：
12.(1)用于制备g蛋白偶联受体的抗体；
13.(2)用于基于g蛋白偶联受体构建的荧光探针；
14.(3)制备用于治疗或预防癌症的药物。
15.进一步，所述制备g蛋白偶联受体的抗体方法如下：
16.(1.1)选择多个多肽免疫原作为同源性相近的两个或以上g蛋白偶联受体蛋白的抗原多肽组，修饰各多肽免疫原，纯化，得到抗原决定簇多肽；
17.(1.2)将质量比为2：9：1的抗原决定簇多肽、血蓝蛋白和sulfo-smcc偶联，纯化，加入弗氏佐剂进行乳化，形成全抗原；抗原决定簇多肽和血蓝蛋白的质量比为1:1；
18.(1.3)将所述全抗原采用多克隆抗体技术制备抗血清；将抗血清进行预处理后，与抗原决定簇多肽、偶联树脂进行拌样混合后装入层析柱，采用ph3.0的甘氨酸缓冲液作为洗脱液，收集洗脱液，得到抗体。
19.进一步，所述基于g蛋白偶联受体构建的荧光探针方法如下：
20.(2.1)荧光探针是对g蛋白偶联受体蛋白进行改造获得的融合蛋白；
21.(2.2)在g蛋白偶联受体蛋白的第五跨膜区和第六跨膜区之间的第三胞内环中插入循环重排的荧光蛋白；
22.所述基于g蛋白偶联受体蛋白构建的荧光探针能够在细胞膜上表达；并且所述基于g蛋白偶联受体蛋白构建的的荧光探针当与所述g蛋白偶联受体蛋白的特异性配体接触时可以与其结合，由此导致荧光探针的荧光强度具有可检测到的变化。
23.进一步，所述改造包括对g蛋白偶联受体蛋白的第五跨膜区和第六跨膜区之间的第三胞内环截短并在截短的位置插入循环重排的荧光蛋白。
24.进一步，所述循环重排的荧光蛋白两端分别通过连接肽与g蛋白偶联受体蛋白的第三胞内环相连。
25.进一步，所述连接肽包括柔性氨基酸；所述柔性氨基酸包括甘氨酸和/或丙氨酸。
26.进一步，所述连接肽由甘氨酸和丙氨酸组成。
27.进一步，所述循环重排的荧光蛋白n端的连接肽为gg，和/或循环重排的荧光蛋白c端的连接肽为ggaaa。
28.进一步，所述循环重排的荧光蛋白选自循环重排的绿色荧光蛋白(cpgfp)、循环重排的黄色荧光蛋白(cpyfp)、循环重排的红色荧光蛋白(cprfp)、循环重排的蓝色荧光蛋白(cpbfp)、循环重排的增强绿色荧光蛋白(cpegfp)、循环重排的增强黄色荧光蛋白(cpeyfp)和循环重排的红外荧光蛋白(cpirfp)；
29.所述循环重排的增强绿色荧光蛋白优选是来自gcamp6s、gcamp6m或g-geco的cpegfp；
30.所述循环重排的红色荧光蛋白是cpmapple、cpmcherry、cpmruby2、cpmkate2和cpfushionred；
31.所述cpmapple是来自r-geco1的cpmapple；优选地，所述循环重排的黄色荧光蛋白包括但不限于循环重排的venus(cpvenus)、循环重排的citrin(cpcitrine)。
32.进一步，所述用途还包括：乳腺癌细胞gpr35通过激活mtor信号通路，增加trap1蛋白的表达，引起乳腺癌细胞线粒体功能损伤，促进肿瘤的发生发展，为临床gpr35为靶点的乳腺癌生物学治疗提供新的思路。
33.结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
34.第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
35.本发明通过制备g蛋白偶联受体的抗体方法制备的抗体可同时识别同源性相近的
g蛋白偶联受体，使用该抗体生产的g蛋白偶联受体试剂盒针对细胞水平g蛋白偶联受体信号快速检测；同时，通过基于g蛋白偶联受体构建的荧光探针方法利用本发明的荧光探针和方法，可以实现对g蛋白偶联受体的特异性配体的高效、准确的检测，有较高的时间分辨率，可以实时追踪g蛋白偶联受体的特异性配体在特定环境中的动态变化。
36.第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
37.本发明通过制备g蛋白偶联受体的抗体方法制备的抗体可同时识别同源性相近的g蛋白偶联受体，使用该抗体生产的g蛋白偶联受体试剂盒针对细胞水平g蛋白偶联受体信号快速检测；同时，通过基于g蛋白偶联受体构建的荧光探针方法利用本发明的荧光探针和方法，可以实现对g蛋白偶联受体的特异性配体的高效、准确的检测，有较高的时间分辨率，可以实时追踪g蛋白偶联受体的特异性配体在特定环境中的动态变化。
附图说明
38.图1是本发明实施例提供的新的g蛋白偶联受体蛋白及其用途流程图。
39.图2是本发明实施例提供的新的g蛋白偶联受体蛋白的用途流程图。
40.图3是本发明实施例提供的制备g蛋白偶联受体的抗体方法流程图。
41.图4是本发明实施例提供的基于g蛋白偶联受体构建的荧光探针方法流程图。
具体实施方式
42.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
43.一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
44.如图1所示，本发明提供一种新的g蛋白偶联受体蛋白制备方法包括以下步骤：
45.s101，在g蛋白偶联受体的n-末端、c-末端或膜内环区3插入真核细胞蛋白，获得g蛋白偶联受体蛋白；
46.所述g蛋白偶联受体为腺苷a2a蛋白；
47.所述真核细胞蛋白选自apc蛋白片段或与该片段序列同源性大于90％的蛋白。
48.如图2所示，本发明提供的新的g蛋白偶联受体蛋白的用途：
49.s201，用于制备g蛋白偶联受体的抗体；
50.s202，用于基于g蛋白偶联受体构建的荧光探针；
51.s203，制备用于治疗或预防癌症的药物。
52.如图3所示，本发明提供的制备g蛋白偶联受体的抗体方法如下：
53.s301，选择多个多肽免疫原作为同源性相近的两个或以上g蛋白偶联受体蛋白的抗原多肽组，修饰各多肽免疫原，纯化，得到抗原决定簇多肽；
54.s302，将质量比为2：9：1的抗原决定簇多肽、血蓝蛋白和sulfo-smcc偶联，纯化，加入弗氏佐剂进行乳化，形成全抗原；抗原决定簇多肽和血蓝蛋白的质量比为1:1；
55.s303，将所述全抗原采用多克隆抗体技术制备抗血清；将抗血清进行预处理后，与
抗原决定簇多肽、偶联树脂进行拌样混合后装入层析柱，采用ph3.0的甘氨酸缓冲液作为洗脱液，收集洗脱液，得到抗体。
56.如图4所示，本发明提供的基于g蛋白偶联受体构建的荧光探针方法如下：
57.s401，荧光探针是对g蛋白偶联受体蛋白进行改造获得的融合蛋白；
58.s402，在g蛋白偶联受体蛋白的第五跨膜区和第六跨膜区之间的第三胞内环中插入循环重排的荧光蛋白；
59.所述基于g蛋白偶联受体蛋白构建的荧光探针能够在细胞膜上表达；并且所述基于g蛋白偶联受体蛋白构建的的荧光探针当与所述g蛋白偶联受体蛋白的特异性配体接触时可以与其结合，由此导致荧光探针的荧光强度具有可检测到的变化。
60.本发明提供的改造包括对g蛋白偶联受体蛋白的第五跨膜区和第六跨膜区之间的第三胞内环截短并在截短的位置插入循环重排的荧光蛋白。
61.本发明提供的循环重排的荧光蛋白两端分别通过连接肽与g蛋白偶联受体蛋白的第三胞内环相连。
62.本发明提供的连接肽包括柔性氨基酸；所述柔性氨基酸包括甘氨酸和/或丙氨酸。
63.本发明提供的连接肽由甘氨酸和丙氨酸组成。
64.本发明提供的循环重排的荧光蛋白n端的连接肽为gg，和/或循环重排的荧光蛋白c端的连接肽为ggaaa。
65.本发明提供的循环重排的荧光蛋白选自循环重排的绿色荧光蛋白(cpgfp)、循环重排的黄色荧光蛋白(cpyfp)、循环重排的红色荧光蛋白(cprfp)、循环重排的蓝色荧光蛋白(cpbfp)、循环重排的增强绿色荧光蛋白(cpegfp)、循环重排的增强黄色荧光蛋白(cpeyfp)和循环重排的红外荧光蛋白(cpirfp)；
66.所述循环重排的增强绿色荧光蛋白优选是来自gcamp6s、gcamp6m或g-geco的cpegfp；
67.所述循环重排的红色荧光蛋白是cpmapple、cpmcherry、cpmruby2、cpmkate2和cpfushionred；
68.所述cpmapple是来自r-geco1的cpmapple；优选地，所述循环重排的黄色荧光蛋白包括但不限于循环重排的venus(cpvenus)、循环重排的citrin(cpcitrine)。
69.二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。
70.本发明通过制备g蛋白偶联受体的抗体方法制备的抗体可同时识别同源性相近的g蛋白偶联受体，使用该抗体生产的g蛋白偶联受体试剂盒针对细胞水平g蛋白偶联受体信号快速检测；同时，通过基于g蛋白偶联受体构建的荧光探针方法利用本发明的荧光探针和方法，可以实现对g蛋白偶联受体的特异性配体的高效、准确的检测，有较高的时间分辨率，可以实时追踪g蛋白偶联受体的特异性配体在特定环境中的动态变化。
71.应当注意，本发明的实施方式可以通过硬件、软件或者软件和硬件的结合来实现。硬件部分可以利用专用逻辑来实现；软件部分可以存储在存储器中，由适当的指令执行系统，例如微处理器或者专用设计硬件来执行。本领域的普通技术人员可以理解上述的设备和方法可以使用计算机可执行指令和/或包含在处理器控制代码中来实现，例如在诸如磁盘、cd或dvd-rom的载体介质、诸如只读存储器(固件)的可编程的存储器或者诸如光学或电
子信号载体的数据载体上提供了这样的代码。本发明的设备及其模块可以由诸如超大规模集成电路或门阵列、诸如逻辑芯片、晶体管等的半导体、或者诸如现场可编程门阵列、可编程逻辑设备等的可编程硬件设备的硬件电路实现，也可以用由各种类型的处理器执行的软件实现，也可以由上述硬件电路和软件的结合例如固件来实现。
72.三、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
73.本发明通过制备g蛋白偶联受体的抗体方法制备的抗体可同时识别同源性相近的g蛋白偶联受体，使用该抗体生产的g蛋白偶联受体试剂盒针对细胞水平g蛋白偶联受体信号快速检测；同时，通过基于g蛋白偶联受体构建的荧光探针方法利用本发明的荧光探针和方法，可以实现对g蛋白偶联受体的特异性配体的高效、准确的检测，有较高的时间分辨率，可以实时追踪g蛋白偶联受体的特异性配体在特定环境中的动态变化。
74.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。