异养型硝化细菌及其制备方法与应用与流程

本发明属于微生物，更具体而言，涉及异养型硝化细菌，本发明还涉及该异养型硝化细菌的制备方法与应用。

背景技术：

1、硝化细菌是一类广泛存在于自然界中的微生物，能通过自身代谢将水体中的氨氮或者亚硝酸盐氮转化成其他形式的氮，在地球氮素循环中扮演着非常重要角色。自1981年由著名微生物学家winogradsky首次从土壤中分离纯化得到硝化细菌，并随后证明其硝化作用的机理，关于硝化细菌的研究就不断开展起来。

2、随着人们生活水平的日益提高，人们对河蟹、对虾、鳖以及各种鱼类的需求量也逐渐增大，这带动了相关水产养殖业的迅速发展。然而，由于使用高密度养殖、大量人工投加饵料使水体氨氮和亚硝酸盐出现积累，当水体中的氮超标时，会引起水体的富营养化，在一定程度上会危害养殖生物的健康，严重时造成死亡。

3、为了解决这一现状，国内外许多研究者和生产益生菌的厂家都致力于开发和生产出作用效果显著、降解效果更好的有益微生物，从而解决养殖过程中氨氮和亚硝酸盐含量超标的问题。

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于提供一株能降解具有硝化或者反硝化功能的菌株，用于解决养殖过程中氨氮和亚硝酸盐含量超标问题。

2、一株异养型硝化细菌，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，分类学名称为trichosporon asahii ，保藏编号为gdmcc no：62690；保藏日期为2022年08月08日，保存地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

3、进一步的，上述的株异养型硝化细菌，其26s rrna序列表seqidno：1所示的序列。

4、进一步的，上述的株异养型硝化细菌，所述的异养型硝化细菌降解具有硝化或者反硝化功能。

5、本发明提供的第二个技术方案是上述异养型硝化细菌的制备方法，依次包括下述步骤：

6、(1)取样：用洗净的塑料桶污水站中取适量泥水混合物，并用气泵曝气；

7、(2)每2～3天从曝气的桶中取100ml水样检测其氨氮、硝酸盐氮及亚硝酸盐氮的含量；

8、(3)菌种富集：待样品中氨氮及亚硝酸盐氮降至0.1mg/l以下后，向桶中加入nh4cl标准溶液，调节样品中的nh4+含量至10mg/l；每2～3天测定其氨氮指标，待其降至最低，重复添加nh4cl标准溶液，以达到富集具有降解氨氮能力菌株的目的。

9、(4)分离纯化：待样品中目的菌数量达到105～108cfu/ml时，均匀取样1ml加入至9ml 无菌水中，为10-1稀释液；以此类推，将样品稀释105～108倍，通过平板涂布法分离样品中的菌株，并对筛选出的菌株进行保存。

10、本发明提供的第三个技术方案是上述的株异养型硝化细菌的测试方法，依次包括下述步骤：

11、(1)培养基配置：根据培养基配方配置对应的硝化、反硝化以及lb培养基，分装、灭菌备用；

12、(2)af-01菌种制备：从已制备的斜面菌种上，分别刮20-28h后，离分离去上清液后，菌泥用等量纯水重悬后备用；

13、(3)测试培养基接种：分别取5ml菌泥重悬液加入至测试所用的硝化、反硝化培养基中，好氧、相对厌氧各一组，本次测试未设重复；

14、(4)数据测定：按照测试依据测定测试培养基中硝酸盐氮、氨氮以及其亚硝酸盐氮含量的变化情况。

15、进一步的，上述的株异养型硝化细菌的测试方法，所述的反硝化培养基制备方法如下：每升培养基需加入ch3coona2.0g、kno32.0g、mgso4.7h2o0.2g、k2hpo41.0g、微量元素培养基 10.0ml，加水充分溶解，调节ph至7.2，121℃高压灭菌30min。

16、进一步的，上述的株异养型硝化细菌的测试方法，所述的硝化培养基制备方法如下：每升培养基需加入ch3coona2.0g、nh4cl0.2g、mgso4.7h2o0.2g、na2hpo40.7g、kh2po41.0g、微量元素培养基10.0ml，加水充分溶解，调节ph至7.2，121℃高压灭菌30min。

17、进一步的，上述的株异养型硝化细菌的测试方法，所述的微量元素培养基制备方法如下：每升培养基需加入edta50.0g、znso42.2g、cacl25.5g、mncl2.4h205.06g、fes04.7h2o5.0g、 (nh4)6mo7o2·4h2o1.1g、cuso4·5h201.57g、cocl2·6h201.61g，加水充分溶解，ph自然，121 ℃高压灭菌30min；

18、所述的lb肉汤培养基制备方法如下：称取21g lb肉汤培养基，加水至1000ml，ph自然，121℃高压灭菌30min。

19、本发明还有一个技术方案是上述的异养型硝化细菌作为污水处理剂的应用。

20、含上述的异养型硝化细菌的缓释型污水处理剂，包括下述重量百分比的组分：多孔木块 25～35％、海藻酸钠溶液0.5～5％、碳酸钙溶液1～5％，余量为重悬后的af-01菌液。

21、与现有技术相比，本发明提供的技术方案在高氨氮浓度以及低氨氮浓度的测试实验、去除亚硝酸盐能力测试实验及菌泥实际应用实验中发现，有良好的去除氨氮及亚硝酸盐氮的能力，可用于各种污水处理，尤其是养殖场的污水处理。

技术特征：

1.一株异养型硝化细菌，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，分类学名称为trichosporon asahii af-01，保藏编号为：gdmcc no：62690；保藏日期为2022年08月08日。

2.根据权利要求1所述的株异养型硝化细菌，其特征在于，其26s rrna序列表seqidno：1所示的序列。

3.根据权利要求1所述的株异养型硝化细菌，其特征在于，所述的异养型硝化细菌降解具有硝化或者反硝化功能。

4.权利要求1所述的株异养型硝化细菌的制备方法，其特征在于，依次包括下述步骤：

5.权利要求1所述的株异养型硝化细菌的测试方法，其特征在于，依次包括下述步骤：

6.根据权利要求5所述的株异养型硝化细菌的测试方法，其特征在于，所述的反硝化培养基制备方法如下：每升培养基需加入ch3coona2.0g、kno32.0g、mgso4.7h2o0.2g、k2hpo41.0g、微量元素培养基10.0ml，加水充分溶解，调节ph至7.2，121℃高压灭菌30min。

7.根据权利要求5所述的株异养型硝化细菌的测试方法，其特征在于，所述的硝化培养基制备方法如下：每升培养基需加入ch3coona2.0g、nh4c10.2g、mgso4.7h2o0.2g、na2hpo40.7g、kh2po41.0g、微量元素培养基10.0ml，加水充分溶解，调节ph至7.2，121℃高压灭菌30min。

8.根据权利要求5所述的株异养型硝化细菌的测试方法，其特征在于，所述的微量元素培养基制备方法如下：每升培养基需加入edta50.0g、znso42.2g、cacl25.5g、mncl2.4h2o5.06g、feso4.7h2o5.0g、(nh4)6mo7o2·4h2o1.1g、cuso4·5h2o1.57g、cocl2·6h2o1.61g，加水充分溶解，ph自然，121℃高压灭菌30min；

9.权利要求1所述的异养型硝化细菌作为污水处理剂的应用。

10.一种含权利要求1所述的异养型硝化细菌的缓释型污水处理剂，其特征在于，包括下述重量百分比的组分：多孔木块25～35％、海藻酸钠溶液0.5～5％、碳酸钙溶液1～5％，余量为重悬后的af-01菌液。

技术总结
本发明公开了一株异养型硝化细菌及其制备方法与应用，该异养型硝化细菌能有效降解具有硝化或者反硝化功能的菌株，用于解决养殖过程中氨氮和亚硝酸盐含量超标问题保藏于广东省微生物菌种保藏中心，分类学名称为Trichosporon asahii AF‑01，保藏编号为：GDMCC No：62690；保藏日期为2022年08月08日；属于生物技术领域。

技术研发人员：刘海龙,谢凯,黄金娟
受保护的技术使用者：负碳生物环保科技（广州）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13