可羟基化黄体酮C11α位的P450酶及其基因、表达载体、细胞及应用

本发明涉及酶基因工程及酶工程，尤其涉及一种可羟基化黄体酮c11α位的p450酶及其基因、表达载体、细胞及应用。

背景技术：

1、孕酮(progesterone)，亦被称为黄体酮、孕甾酮、黄体甾酮、助孕激素、助孕素、黄体素或助孕酮，其缩写为p4，全称孕甾-4-烯-3,20-二酮，是一种内源性类固醇和孕激素性激素，也是在体内的主要孕激素，由女性的卵巢分泌。黄体酮是由卵巢黄体细胞分泌的一种含有21个碳原子的类固醇激素，也是合成一切类固醇激素的中间产物，属于孕激素之一。有两种晶型，即α-型和β-型，两种晶型有类似的生理活性，α-型是从稀乙醇中析出，为正交晶系白色棱柱状结晶，β-型为正交晶系白色针状结晶，二者均不溶于水，溶于乙醇、乙醚、氯仿、丙酮等。自然界中，黄体酮广泛存在于动物体内，有维持雌性动物的妊娠，促进子宫粘膜层增厚、腺体的弯曲度以及分泌机能的增加等生理功能。甾醇的羟基化反应是指在有机分子上引入羟基的反应，甾体类化合物通过羟基化修饰后，一般会表现出更好的药理活性，常见的羟基化黄体酮药物中间体有11α-oh-黄体酮，作为黄体酮最重要的羟化中间体之一，11α-oh-黄体酮又被称为11α-oh-孕酮，分子式为c21h30o3，相对分子质量为330.46，报道称其可以选择性地抑制11β-羟基类固醇脱氢酶ii，这是一种在调节肾脏电解质平衡中很重要的酶，它能将人体内的皮质醇代谢成肾上腺皮质酮，因此，11α-oh-黄体酮可以影响血压调节。此外，11α-oh-黄体酮具有抗雄激素活性，对雌激素和孕激素副作用较小，所以在临床应用研究领域具有很大的潜力。

2、11α-oh-黄体酮的制备方法包括化学法和生物法。化学法合成11α-oh-黄体酮的合成路线是以11α-乙酰黄体酮为原料，通过多步缩合，开环和异构化等反应获得11α-oh-黄体酮，该过程反应步骤多、转化率低，且分离纯化过程复杂。1952年，peterson和murray首次发现黑根霉(rhizopusnigricans)对甾体具有c-11α羟化能力，从而使黄体酮到皮质酮的合成缩短为三步，收率达90％，从此解决了可的松等皮质激素类化合物合成的难题，由此开创了微生物转化甾体化合物的先例。

3、目前关于黄体酮微生物羟基转化的研究非常广泛，如黄竹梅(黄体酮和环氧黄体酮微生物羟基转化的研究,四川师范大学,2013.doi:10.7666/d.y2301348.)使用新月弯孢霉和蓝色犁头霉菌分别对黄体酮进行发酵转化，转化液经萃取、浓缩，获得产物粗产品，再通过硅胶柱层析分离纯化，发现黄体酮的转化产物中含有11α-oh-黄体酮；专利cn202110142291.8公开了一种利用固定化羟化酶转化制备11α,17α-羟基黄体酮的方法，以17α-oh-黄体酮为底物制备11α,17α-oh-黄体酮；专利cn202010405130.9公开了一种11α-羟化酶突变体，基于该突变体构建的重组毕赤酵母可转化底物黄体酮为11α-oh-黄体酮。但以上针对黄体酮微生物羟基转化的方法多是利用真菌等真核体系进行生物催化，真菌催化虽然转化效率良好，但其遗传特性不清晰，分子操作体系不完善，且转化过程中伴随诸多副产物，不利于下游产物高效分离等工作的进行，而对于细菌等原核体系，随着近些年生物技术的飞速发展，其遗传操作体系已非常成熟，因此需要寻找一种新的利用原核生物体系制备11α-oh-黄体酮的方法。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种来自于巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)h-1的p450黄体酮羟化酶的氨基酸序列以及其编码该蛋白的核苷酸序列，提供包含本发明基因的质粒及包含表达质粒的宿主细胞，并利用宿主细胞(枯草芽孢杆菌)表达该黄体酮羟化酶后能有效转化黄体酮为11α-oh-黄体酮。

2、本发明的第一个目的是提供一种可羟基化黄体酮c11α位的p450酶，该可羟基化黄体酮c11α位的p450酶可催化黄体酮的c11位羟基化并转化为11α-oh-黄体酮，其氨基酸序列如seq id no.1所示。具体序列如下：

3、

4、本发明的第二个目的是提供一种编码上述可羟基化黄体酮c11α位的p450酶的基因。

5、进一步地，所述编码上述可羟基化黄体酮c11α位的p450酶的基因，其核苷酸序列如seq id no.2所示。具体序列如下：

6、

7、

8、本发明的第三个目的是提供一种重组质粒，该重组质粒含有编码可羟基化黄体酮c11α位的p450酶的基因。

9、进一步地，在本发明的一个实施例中，所述重组质粒以pma5为载体骨架。

10、本发明的第四个目的是提供一种表达上述可羟基化黄体酮c11α位的p450酶的细胞，该细胞中含有编码可羟基化黄体酮c11α位的p450酶的基因或含有编码可羟基化黄体酮c11α位的p450酶的基因的重组质粒。

11、进一步地，所述细胞包括但不限于细菌、真菌、植物细胞、动物细胞等。

12、进一步地，当宿主细胞为细菌时，优选枯草芽孢杆菌。

13、进一步地，上述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)wb600为宿主，以pma5为表达载体。

14、本发明的第五个目的是提供上述可羟基化黄体酮c11α位的p450酶、编码可羟基化黄体酮c11α位的p450酶的基因、含有所述基因的表达载体或细胞在制备11α-oh-黄体酮中的应用。

15、进一步地，以黄体酮为底物，通过微生物羟基化其c11α位生成11α-oh-黄体酮。

16、进一步地，采用重组枯草芽孢杆菌合成11α-oh-黄体酮时，将重组枯草芽孢杆菌接种至lb液体培养基中培养，得到种子液；将种子液接种至lb培养基中，发酵制备11α-oh-黄体酮；其中，lb液体培养基的成分包括1-10g/l酵母粉、5-15g/l蛋白胨和5-15g/l nacl；lb培养基的成分包括5-15g/l蛋白胨、5-15g/l氯化钠和1-10g/l酵母粉。

17、进一步地，底物黄体酮的浓度优选为0.5g/l。

18、进一步地，在底物中加入甘油、吐温80和hp-β-cd中的一种或多种进行助溶。

19、进一步地，表达可羟基化黄体酮c11α位的p450酶的重组枯草芽孢杆菌发酵生产11α-oh-黄体酮时，发酵条件为30-40℃，ph6.0-8.0，优选为35-37℃，ph7.0-7.5，最优选为37℃，ph7.0。

20、本发明的可羟基化黄体酮c11α位的p450酶在制药和制备饲料(如作为动物饲料添加剂)等方面均有巨大应用潜力。

21、借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

22、本发明提供了一种可羟基化黄体酮c11α位的p450酶cyp bmh3，并将基因cyp bmh3插入pma5质粒中构建重组表达质粒pma5-cyp bmh3，以枯草芽孢杆菌wb600为表达宿主，实现可羟基化黄体酮c11α位的p450酶cyp bmh3的异源表达，且成功实现了对黄体酮的高效转化，同时专一性高，无反应副产物，降低了生产成本，为其进一步的工业化应用奠定基础。

23、上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。