适用于mNGS检测的样本前处理方法与流程

本申请涉及分子生物学，尤其涉及适用于mngs检测的样本前处理方法。

背景技术：

1、宏基因组新一代测序技术(mngs)，不依赖于传统的微生物培养，直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，然后与数据库进行比对分析，根据比对到的序列信息来判断样本包含的病原微生物种类，能够快速、客观地检测临床样本中的较多病原微生物(包括细菌、真菌、寄生虫及病毒)，尤其适用于急危重症和疑难感染的诊断。mngs湿实验包括样本前处理、核酸提取、文库构建及上机测序。mngs的临床样本主要有肺泡灌洗液、痰液、脑脊液等，而不同的临床样本比较复杂，差异较大，需要在核酸提取前进行样本的差异化前处理，针对性的提升病原体检出。

2、由于细菌、真菌、病毒和寄生虫等各种微生物特性不同，样本前处理和核酸提取的方法需要兼容不同微生物的特征。对于提取比较难破壁的细菌和真菌核酸时，常规的方法对此类微生物的提取效果较差，其测序检出结果也较差。

技术实现思路

1、本申请实施例的目的在于提出一种适用于mngs检测的样本前处理方法，提升测序检出结果。

2、为了解决上述技术问题，本申请实施例提供一种适用于mngs检测的样本前处理方法，采用了如下所述的技术方案：

3、一种适用于mngs检测的样本前处理方法，包括下述步骤：

4、对待处理的样本进行研磨预处理操作，获得匀质样本；

5、对所述匀质样本进行核酸提取操作，获得目标核酸；

6、根据所述目标核酸进行二代测序文库构建，获得目标dna测序文库；

7、将所述目标dna测序文库依次进行磁珠纯化及pcr处理，获得适用于mngs检测的样本。

8、进一步的，所述对待处理的样本进行研磨预处理操作，获得匀质样本的步骤包括：

9、向装有研磨珠的研磨管中加入所述待处理的样本和裂解液；

10、将所述研磨管置于专用的匀质仪器中进行研磨操作，获得所述匀质样本。

11、进一步的，所述研磨珠为锆珠。

12、进一步的，所述锆珠的粒径为0.2mm。

13、进一步的，所述匀质仪器为漩涡振荡器vortex-genie2。

14、进一步的，所述匀质仪器的研磨条件为：以最大速度研磨15min～20min。

15、进一步的，所述向装有研磨珠的研磨管中加入所述待处理的样本和裂解液的步骤包括：

16、向装有研磨珠的研磨管中加入400μl所述待处理的样本和1ml裂解液。

17、进一步的，所述对所述匀质样本进行核酸提取操作，获得目标核酸的步骤包括：

18、根据所述待处理的样本的数量，在96深孔板的第3列和第9列中加入600μl的第一洗涤液；

19、根据所述待处理的样本的数量，在96深孔板的第4列、第5列、第10列和第11列中加入600μl的第二洗涤液；

20、根据所述待处理的样本的数量，在96深孔板的第6列和第12列中加入60μl的洗脱液；

21、根据所述待处理的样本的数量，在96深孔板的第1列、第2列、第7列和第8列中均按顺序加入20μl磁珠、20μl蛋白酶k和所述匀质样本；

22、将所述96深孔板放入smart32型全自动核酸提取仪中，运行核酸提取程序，获得所述目标核酸。

23、进一步的，所述smart32型全自动核酸提取仪的核酸提取程序为：

24、所述96深孔板的第一孔位和第二孔位进行裂解操作；

25、所述96深孔板的第三孔位、第四孔位和第五孔位进行洗涤操作；

26、所述96深孔板的第六孔位进行洗脱操作；

27、所述96孔板饿第四孔位进行弃磁操作。

28、进一步的，所述对所述匀质样本进行核酸提取操作，获得目标核酸的步骤包括：

29、步骤1：在灭菌的2ml离心管中加入40ul磁珠、40μl蛋白酶k及匀质后的样本，充分涡旋混匀；

30、步骤2：将离心管置于恒温震荡金属浴中，70℃孵育12min，瞬时离心；

31、步骤3：将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，用移液器去除液体；

32、步骤4：往离心管中加入600μl第一洗涤液，涡旋混匀1min，瞬时离心；

33、步骤5：将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，用移液器去除液体；

34、步骤6：往离心管中加入600μl第二洗涤液，涡旋混匀1min，瞬时离心；

35、步骤7：将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，用移液器去除液体；

36、步骤8：重复步骤5和步骤6；

37、步骤9：将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，用移液器去除液体，开盖晾干；

38、步骤10：往离心管中加入60μl～120μl洗脱液，涡旋混匀，室温孵育5min后，置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，获得所述目标核酸。

39、与现有技术相比，本申请实施例主要有以下有益效果：

40、对于提取比较难破壁的细菌和真菌核酸时，本申请的前处理方法能够改善提取的效果，针对性的提升真菌检出，测序检出结果较好。

技术特征：

1.一种适用于mngs检测的样本前处理方法，其特征在于，包括下述步骤：

2.根据权利要求1所述的适用于mngs检测的样本前处理方法，其特征在于，所述对待处理的样本进行研磨预处理操作，获得匀质样本的步骤包括：

3.根据权利要求2所述的适用于mngs检测的样本前处理方法，其特征在于，所述研磨珠为锆珠。

4.根据权利要求3所述的适用于mngs检测的样本前处理方法，其特征在于，所述锆珠的粒径为0.2mm。

5.根据权利要求2所述的适用于mngs检测的样本前处理方法，其特征在于，所述匀质仪器为漩涡振荡器vortex-genie2。

6.根据权利要求2所述的适用于mngs检测的样本前处理方法，其特征在于，所述匀质仪器的研磨条件为：以最大速度研磨15min～20min。

7.根据权利要求2所述的适用于mngs检测的样本前处理方法，其特征在于，所述向装有研磨珠的研磨管中加入所述待处理的样本和裂解液的步骤包括：

8.根据权利要求1所述的适用于mngs检测的样本前处理方法，其特征在于，所述对所述匀质样本进行核酸提取操作，获得目标核酸的步骤包括：

9.根据权利要求8所述的适用于mngs检测的样本前处理方法，其特征在于，所述smart32型全自动核酸提取仪的核酸提取程序为：

10.根据权利要求1所述的适用于mngs检测的样本前处理方法，其特征在于，所述对所述匀质样本进行核酸提取操作，获得目标核酸的步骤包括：

技术总结
本申请实施例属于分子生物学技术领域，涉及一种适用于mNGS检测的样本前处理方法，包括对待处理的样本进行研磨预处理操作，获得匀质样本；对所述匀质样本进行核酸提取操作，获得目标核酸；根据所述目标核酸进行二代测序文库构建，获得目标DNA测序文库；将所述目标DNA测序文库依次进行磁珠纯化及PCR处理，获得适用于mNGS检测的样本。本申请提升测序检出结果。

技术研发人员：蒋析文,梁志坤,梁焱,吴轶兰,袁亚丽
受保护的技术使用者：广州达安基因股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/11