NADH脱氢酶突变体及其应用的制作方法

本发明属于微生物，具体地说，涉及一种nadh脱氢酶突变体及其应用。

背景技术：

1、谷氨酸棒杆菌是一种需氧、生长快速、不产孢子、短杆棒状、非致病性的革兰氏阳性微生物。谷氨酸棒杆菌从被分离以来，被广泛应用于氨基酸的生产。由于其易于遗传操作以及生长速度快，发酵周期短，还被应用于除氨基酸生产以外的有机酸、醇、类胡萝卜素等的生产，是科研和工业生产中重要的模式生物。

2、nadh是细胞内重要的辅因子，广泛参与细胞内氧化还原反应。单一代谢途径的强化会导致细胞内还原力的不平衡，还原力的不平衡是导致目标化合物产率低下的一个重要因素。因此调控细胞内nad(h)的水平是代谢工程中改善菌株生产性能的一个重要手段。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种nadh脱氢酶突变体及其应用。

2、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种nadh脱氢酶突变体，所述突变体包含nadh脱氢酶第102位氨基酸由g到c或a的突变，优选g102c。

3、本发明中，nadh脱氢酶在ncbi上的参考序列编号为bbd29_07900。

4、第二方面，本发明提供编码所述nadh脱氢酶突变体的核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料。

5、所述生物材料包括但不限于重组dna、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。

6、第三方面，本发明提供所述核酸分子或所述生物材料在提高微生物的谷氨酸产量、生产强度或转化率中的应用。

7、第四方面，本发明提供一种重组微生物，所述微生物表达所述的nadh脱氢酶突变体。

8、优选地，所述重组微生物是将编码nadh脱氢酶的基因突变为编码所述nadh脱氢酶突变体的基因构建得到的。

9、所述重组微生物为棒杆菌属(corynebacterium)菌种，优选谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)。

10、进一步地，所述重组微生物的出发菌株为能够积累谷氨酸的谷氨酸棒杆菌。

11、优选地，所述出发菌株为mhz-0112-8(谷氨酸棒杆菌mhz-0112-8保藏编号cgmccno.11941，参见cn105695383a)。

12、第五方面，本发明提供所述重组微生物的构建方法，其是将所述nadh脱氢酶突变体的基因通过质粒导入微生物中或通过基因工程手段整合到微生物染色体上，或者，将出发菌株中编码nadh脱氢酶的基因突变为编码所述nadh脱氢酶突变体的基因。

13、第六方面，本发明提供所述重组微生物在谷氨酸发酵生产中的应用。

14、第七方面，本发明提供一种生产谷氨酸的方法，包括将所述重组微生物进行发酵培养的步骤。

15、优选地，发酵所用培养基为：葡萄糖50-60g/l，硫酸铵10-20g/l，kh2po4 0.5-1.5g/l，mgso4·7h2o 0.2-0.5g/l，feso4·7h2o 0.05-0.15mg/l，mnso4·5h2o 0.05-0.15mg/l，vb1 150-250μg/l，生物素250-350μg/l，豆粕水解液0.3-0.6g/l，ph 7.2-7.5。

16、本发明通过将谷氨酸棒杆菌野生型bbd29_07900基因编码的蛋白第102位甘氨酸突变为半胱氨酸或丙氨酸，获得特定突变体，显著提高了l-谷氨酸生产菌株中相应目标氨基酸的产量及转化率。

技术特征：

1.nadh脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体包含nadh脱氢酶第102位氨基酸由g到c或a的突变；

2.编码权利要求1所述nadh脱氢酶突变体的核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料；

3.权利要求2所述核酸分子或所述生物材料在提高微生物的谷氨酸产量、生产强度或转化率中的应用。

4.一种重组微生物，其特征在于，所述微生物表达权利要求1所述的nadh脱氢酶突变体；

5.根据权利要求4所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物为棒杆菌属(corynebacterium)菌种，优选谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)。

6.根据权利要求5所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物的出发菌株为能够积累谷氨酸的谷氨酸棒杆菌；

7.权利要求4-6任一项所述重组微生物的构建方法，其特征在于，将编码权利要求1所述nadh脱氢酶突变体的基因通过质粒导入微生物中或通过基因工程手段整合到微生物染色体上，或者，将出发菌株中编码nadh脱氢酶的基因突变为编码权利要求1所述nadh脱氢酶突变体的基因。

8.权利要求4-6任一项所述重组微生物在谷氨酸发酵生产中的应用。

9.一种生产谷氨酸的方法，其特征在于，包括将权利要求4-6任一项所述重组微生物进行发酵培养的步骤；

技术总结
本发明提供一种NADH脱氢酶突变体及其应用。将谷氨酸棒杆菌野生型BBD29_07900基因编码的蛋白第102位甘氨酸突变为半胱氨酸或丙氨酸，获得特定突变体，显著提高了L‑谷氨酸生产菌株中相应目标氨基酸的产量及转化率。本发明为谷氨酸发酵生产提供有效手段。

技术研发人员：牛松峰,程江红,赵津津,李岩
受保护的技术使用者：廊坊梅花生物技术开发有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/17