一种利用动物防御素融合异源蛋白的细胞表面展示方法

本发明属于生物工程，具体涉及一种异源蛋白在大肠杆菌和毕赤酵母细胞表面展示的技术。

背景技术：

1、将异源蛋白锚定在细胞表面的展示技术因其可应用于几乎所有类型的生物体而被广泛应用于药物筛选、生物催化、生物传感器等领域(park,m.surface displaytechnology for biosensor applications:a review.2020)。该技术的核心是将靶蛋白基因序列与特定载体基因序列融合，引入受体细胞，利用受体细胞内的蛋白质转运机制，将靶蛋白表达并锚定在细胞表面。常用的大肠杆菌转运蛋白包括冰核蛋白和s层蛋白(blooisetal.decorating microbes:surface display of proteins on escherichia coli.2011)。然而，由于高度依赖受体细胞的蛋白质转运机制，原核/真核体系通用的表面展示技术尚未开发。

2、防御素是一类富含二硫键的阳离子抗菌肽，广泛分布于真菌、植物和动物体内，是生物免疫系统中具有直接杀菌功能的重要调节分子。防御素杀菌机理主要与微生物的细胞膜结构有关：带正电荷的防御素分子或其多聚体可以与细胞膜上带负电荷的磷脂和水分子相互作用，增加生物膜的通透性，导致细胞内容物的渗漏。通过模仿防御素的这一特性，已开发出一些肽类聚合物，它们在杀死耐药细菌方面非常有效(zhang et al.host defensepeptide mimicking cyclic peptoid polymers exerting strong activity againstdrug-resistant bacteria.2022)。目前尚没有将防御素应用在细胞表面展示技术中的相关报道。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的在于，提供一种利用动物防御素融合异源蛋白的细胞表面展示方法，无须借助宿主细胞蛋白转运系统，即可实现异源蛋白在原核和真核细胞表面展示，同时可以减少宿主能量和代谢负担。

2、本发明的第二个目的在于，提供动物防御素在细胞表面展示技术中的应用，利用防御素与细胞膜的静电相互作用实现细胞表面展示，成为一个原核和真核体系通用的表面显示方法。

3、为了实现上述目的，本发明提供了一种利用动物防御素融合异源蛋白的细胞表面展示方法，将恒河猴白细胞θ-防御素单体或多聚体与异源蛋白通过接头连接，在宿主菌中诱导表达，实现异源蛋白展示在宿主菌表面。

4、作为一个优选方案，所述宿主菌为大肠杆菌或毕赤酵母。利用防御素与细胞膜静电作用实现蛋白表面展示，并不依赖受体细胞的蛋白质转运机制，通用于原核/真核体系。本发明优选实施例选择大肠杆菌和毕赤酵母作为宿主菌，因为它们分别是最常用的原核蛋白表达系统和真核蛋白表达系统。事实上，枯草芽孢杆菌，乳酸菌，酿酒酵母等都可作为宿主菌。

5、作为一个优选方案，所述恒河猴白细胞θ-防御素多聚体聚集度为2-6。恒河猴白细胞θ-防御素多聚体是指多段重复的恒河猴白细胞θ-防御素氨基酸序列。

6、作为一个优选方案，所述接头包括一段或多段刚性接头或柔性接头。所述接头是指两个融合蛋白间起连接作用的氨基酸链，具有一定的柔性以允许两侧的蛋白完成各自独立的功能。

7、作为一个优选方案，所述接头是eaaak，apapapapapapap，aayaay，ptppttptppttptptp，ggggs中的一种或几种(seq id no.1—seq id no.5)。接头可以是单个或者叠加多个，本发明优选实施例中为1—6个接头。

8、作为一个优选方案，所述恒河猴白细胞θ-防御素单体或多聚体与异源蛋白的c末端连接。异源蛋白的的n端可能包含会被切除的信号肽或前体肽，所以一般选择和蛋白的c末端连接。

9、为了实现本发明第二个目的，本发明公开动物防御素在细胞表面展示技术中的应用，所述动物防御素为恒河猴白细胞θ-防御素。

10、作为一个优选方案，所述细胞为大肠杆菌或毕赤酵母细胞。

11、本发明的优点在于，本发明提供了一种不借助宿主细胞蛋白转运系统，即可实现异源蛋白在原核和真核细胞表面展示的通用技术，同时可以减少宿主能量和代谢负担。融合蛋白设计和制备简单，可通过常规方法诱导表达，不需要复杂的分子操作。异源蛋白展示效果好，与细胞膜结合紧密，宿主细胞可作为全细胞催化剂，可连续、反复多次使用，活性保持良好，解决了游离酶反应难以回收、成本高的技术问题。

技术特征：

1.一种利用动物防御素融合异源蛋白的细胞表面展示方法，其特征在于，将恒河猴白细胞θ-防御素单体或多聚体与异源蛋白通过接头连接，在宿主菌中诱导表达，实现异源蛋白展示在宿主菌表面。

2.根据权利要求1所述的一种利用动物防御素融合异源蛋白的细胞表面展示方法，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌或毕赤酵母。

3.根据权利要求1所述的一种利用动物防御素融合异源蛋白的细胞表面展示方法，其特征在于，所述恒河猴白细胞θ-防御素多聚体聚集度为2-6。

4.根据权利要求1所述的一种利用动物防御素融合异源蛋白的细胞表面展示方法，其特征在于，所述接头包括一段或多段刚性接头或柔性接头。

5.根据权利要求1所述的一种利用动物防御素融合异源蛋白的细胞表面展示方法，其特征在于，所述接头是eaaak，apapapapapapap，aayaay，ptppttptppttptptp，ggggs中的一种或几种。

6.根据权利要求1所述的一种利用动物防御素融合异源蛋白的细胞表面展示方法，其特征在于，所述恒河猴白细胞θ-防御素单体或多聚体与异源蛋白的c末端连接。

7.动物防御素在细胞表面展示技术中的应用，其特征在于，所述动物防御素为恒河猴白细胞θ-防御素。

8.根据权利要求7所述动物防御素在细胞表面展示技术中的应用，其特征在于，所述细胞为大肠杆菌或毕赤酵母细胞。

技术总结
本发明提供一种利用动物防御素融合异源蛋白的细胞表面展示方法，将恒河猴白细胞θ‑防御素单体或多聚体与异源蛋白通过接头连接，在宿主菌中诱导表达，实现异源蛋白展示在宿主菌表面。本发明操作简单，展示效果好，无需借助宿主菌自身的蛋白转运系统，是一种原核/真核系统通用的表面展示技术。本发明融合蛋白设计和制备简单，可通过常规方法诱导表达，不需要复杂的分子操作。异源蛋白展示效果好，与细胞膜结合紧密，宿主细胞可作为全细胞催化剂，可连续、反复多次使用，活性保持良好，解决了游离酶反应难以回收、成本高的技术问题。

技术研发人员：李志敏,李宗霖,娄龙威
受保护的技术使用者：华东理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24