一种维氏气单胞菌噬菌体pAEv1818及其应用

一种维氏气单胞菌噬菌体paev1818及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种维氏气单胞菌噬菌体paev1818及其应用。


背景技术：

2.鲫鱼(carassius auratus)是淡水养殖鱼类的常见品种，属于鲫属（carassius）。每年因细菌性病害导致的淡水养殖鱼类损失高。研究证明气单胞菌败血症是影响鲫鱼养殖业的最主要细菌性传染病，并且长期以来研究人员认为嗜水气单胞菌（aeromonas hydrophila）是该病的主要病原。由农科院饲料研究所水产动物饲料创新团队最新研究结果表明，维氏气单胞菌（aeromonas veronii）的毒力强于嗜水气单胞菌，是鲫鱼养殖业的主要致病菌，相关研究结果以封面文章发表在environmental microbiology上。同时维氏气单胞菌也是公认的人、畜及水产动物共患的条件致病菌，可引发目标动物表皮溃疡、肠炎及出血性败血症。
3.通常为解决鲫鱼养殖业中的细菌性败血症问题，会使用疫苗或着大量的抗生素，然而针对该病的减毒疫苗或者抗生素类药物已使用多年，气单胞菌败血症的爆发及其引发的经济损失并未减少。同时抗生素的过量使用引发了新的环境问题，并加剧了鲫鱼的病毒病危害，严重阻遏了鲫鱼养殖业的可持续发展，因此亟需新型的抑菌方式。到目前为止，国际研究领域的主流替代方式是采用噬菌体疗法，已涉及诸多领域，如农业、畜牧业、水产养殖、食品安全保障甚至是人类皮肤烧伤治疗等。噬菌体是一类感染细菌、真菌的病毒的总称，其能够特异识别并裂解宿主病原菌，当前关于应用噬菌体疗法控制细菌性疾病的研究已然成为一种新的热点与趋势，并逐渐得到权威机构的认可。
4.与传统的抗生素相比，噬菌体治疗的突出优势在于：（1）专一性裂解目标病原微生物，不会破坏水环境中的正常菌群。传统的抗生素治疗在杀灭致病菌的同时，也破坏了水体中正常的微生物群落，引起微生态失衡，并导致机会性感染；（2）噬菌体是宿主依赖性的，只在细菌感染部位发生作用，随着宿主菌的清除而消亡，不会残留在动物体内；（3）噬菌体能够自我复制增殖，且其感染发生在水体介质中；（4）安全无毒副作用，噬菌体由蛋白质和核酸组成，降解后的终产物是氨基酸和核酸片段，对人和动物安全。
5.通过各地实施水产养殖用药减量行动，参与行动养殖企业使用兽药总量同比平均减少5%以上，使用抗生素类兽药平均减少20%以上；实现饲料零药物添加，并鼓励积极探索使用兽用抗菌药替代品，逐步减少促生长兽用抗菌药使用品种和使用量，提高健康养殖水平。噬菌体作为预防和治疗水产养殖中细菌疾病药物的几种应用模式已有记载，包括拌饲投喂、肌内或腹腔内给药、肛门插管以及浸没或直接释放于培养体系中。虽然每种应用模式各有利弊，但主要取决于细菌病原体的性质。目前可以查阅到的噬菌体及其应用类相关专利主要涉及弧菌（zl201410108994）及杆菌噬菌体（zl201410235510）方面，而在气单胞菌属范畴未见报道，因此本发明申请尚属首次。


技术实现要素：

6.为了预防鲫鱼养殖过程中由维氏气单胞菌引起的细菌性败血症，降低由该病引起的死亡率，基于苗期鲫鱼放养的池塘养殖模式和气单胞菌爆发特点，本发明提供了一种能够在鲫鱼放养时以及放养后用于浸浴或直接喷洒于池塘的维氏气单胞菌噬菌体制剂，同时提供了该噬菌体的应用策略。
7.为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：一种维氏气单胞菌噬菌体paev1818，所述噬菌体以维氏气单胞菌aev1810为宿主分离得到，该噬菌体于2020年9月10日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为cgmcc no.20295，分类命名为维氏气单胞菌噬菌体；中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。
8.本技术的另外一个目的在于，保藏编号为cgmcc no.20295的维氏气单胞菌噬菌体paev1818在制备维氏气单胞菌抑制剂中的应用。
9.本技术的另外一个目的在于，保藏编号为cgmcc no.20295的维氏气单胞菌噬菌体paev1818在制备预防由维氏气单胞菌引起的疾病的药物中的应用。
10.进一步的，所述由维氏气单胞菌引起的疾病为败血症。
11.本技术的另外一个目的在于，保藏编号为cgmcc no.20295的维氏气单胞菌噬菌体paev1818在杀灭空间环境中维氏气单胞菌的应用。
12.进一步的，所述空间环境包括水体、地面、淤泥、粪便、垫料和饲料。
13.进一步的，所述维氏气单胞菌噬菌体paev1818在杀灭空间环境中维氏气单胞菌的应用具体步骤为：在苗期鲫鱼（10-15g）进行大水体放养时，将鲫鱼浸浴所述噬菌体的悬浮液中，施用量≥108pfu/l水体。
14.进一步的，所述维氏气单胞菌噬菌体paev1818在杀灭空间环境中维氏气单胞菌的应用具体步骤为：将所述噬菌体悬浮液稀释后对养殖池进行喷洒，每隔10天喷洒1次，连续进行3次，每次施用量≥105pfu/m3养殖水体。
15.本技术还公开了一种抑菌剂，包括保藏编号为cgmcc no.20295的维氏气单胞菌噬菌体paev1818。
16.本技术维氏气单胞菌噬菌体尾部长96
ꢀ±ꢀ
1.1nm，头部直径为35
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1.2 nm，具有狭长的尾部结构，属长尾噬菌体科（siphoviridae）；一步生长曲线表明该噬菌体感染宿主的潜伏期为40 min，裂解期为80 min，裂解量为190 pfu/cell，裂解性强。
17.有益效果：本发明提供的一种维氏气单胞菌噬菌体paev1818及其应用和现有技术相比具有以下优点：1. 维氏气单胞菌感染是鲫鱼养殖过程中严重的细菌性疾病，使用本发明裂解性噬菌体，以浸浴或泼洒的方式施用噬菌体，可降低维氏气单胞菌丰度，有效预防养殖过程中维氏气单胞菌的感染，提高苗期鲫鱼成活率，减少经济损失；2. 使用本发明噬菌体控制维氏气单胞菌丰度，可一定程度替代抗生素防治细菌性感染，可减少抗生素在刺参养殖过程中的使用量，降低耐药菌株的出现几率，提高抗生素治疗其他疾病的作用效果，从源头上维护养殖业生产安全和生态环境安全；3. 本发明噬菌体制剂可代替传统化药、抗生素的使用，具有无公害，无残留，廉
价、高效抗菌等特点，是一种应用前景广阔、潜力巨大的天然抑菌剂。
附图说明
18.图1为本技术维氏气单胞菌噬菌体paev1818的噬菌斑及电镜图片，其中左图为维氏气单胞菌噬菌体paev1818的噬菌斑，右图为维氏气单胞菌噬菌体paev1818的电镜图片；图2为本技术维氏气单胞菌噬菌体paev1818的一步生长曲线图；图3为本技术维氏气单胞菌噬菌体paev1818体外抑菌曲线图；图4为本技术鲫鱼细菌败血症图；图5为本技术维氏气单胞菌噬菌体paev1818对鲫鱼存活率的影响图。
19.具体实施方式
20.根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
21.实施例1维氏气单胞菌噬菌体paev1818的筛选和纯化（一）水样采集及处理取来自于盐城某鲫鱼养殖基地及某水产市场排污口废水样品各200ml，混合后对水样做预处理：加入cacl2、mgcl2，使其终浓度为1mmol/l，作用10min。
22.（二）水样噬菌体的富集将上述经过预处理的水样，10000g离心5min，收集上清；将上清过0.22μm滤膜，除菌体、杂质其他成分，即得噬菌体原液；取10ml滤液加入处于对数生长期（接种后5h，噬菌体终浓度达到10
6-107cfu/ml时，即对数生长期）的50ml菌液中，28℃过夜培养12-18h，目的是使噬菌体数量扩增，观察并记录；收集菌液，10000g离心5min，收集上清，再过滤膜（0.22μm），即得增殖后的噬菌体上清液。
23.（三）维氏气单胞菌噬菌体paev1818的筛选采用双层平板法进行噬菌体的鉴定，下层为1.5%琼脂的2216e固体培养基，置于4℃备用，用前放于28℃，30min；上层为0.7%琼脂2216e培养基，将上层培养基加热溶解，放置于50℃的水浴锅中待用，取8支10ml离心管，分别加1ml宿主菌液，吸取噬菌体悬浮液进行梯度稀释至10-6
，将7种不同浓度梯度的噬菌体稀释液分别取出10μl，加到10ml离心管中，设置一个对照组，仅加入1ml宿主菌液和10μl2216e培养基，在28℃下作用10min，加入5ml含0.5%琼脂的2216e培养基充分混匀后，立刻加到上层，待凝固后，倒置培养24h后观察有无噬菌斑形成。如果在平板上形成空斑则说明在滤液内有针对该宿主菌的裂解性噬菌体存在。
24.（四）维氏气单胞菌噬菌体paev1818的纯化初次分离的噬菌斑的大小、形状不一致，对分离的噬菌体进一步的纯化，使噬菌体在平板上形成大小及形态一致的噬菌斑。用无菌200μl枪头挑取形态大小有明显差异的噬菌斑各一个，将其分别加入到1ml无菌pbs的离心管中，涡旋震荡1min，置于4℃，4h，使噬
菌体充分释放入pbs中；4℃、10000 g离心5 min，收集上清，过膜（0.22 μm），将噬菌体滤液进行梯度稀释，双层培养，重复3次上述操作，直至出现的噬菌斑形态、大小完全一致为止，即得到纯化噬菌体。纯化后的噬菌体进行透射电镜观察，噬菌体电镜照片见附图1。
25.（五）维氏气单胞菌噬菌体paev1818的富集与扩增采用液体增殖法进行增殖。具体的方法如下：将噬菌体液加入到培养12 h的宿主菌液中，再于28℃摇床中培养12 h，将混合液于4℃、10000 g离心5 min，去处细菌碎片，上清液用0.22 μm的滤膜过滤，即可获得高效价的噬菌体富集液。
26.实施例2维氏气单胞菌噬菌体paev1818一步生长曲线测定噬菌体感染复数（multiplicity of infection, moi）是指初始感染时加入噬菌体和宿主菌数量的比值。在宿主菌液中加入感染复数为0.1的噬菌体，混匀，28℃静置，吸附15 min；4℃ 11000 rpm离心10 min，弃上清，沉淀用lb 液体培养基重悬，重复上述离心操作，除尽未吸附的噬菌体。沉淀重悬于100 ml lb 液体培养基中，此时计时为t0=0；28℃ 120 rpm培养，每隔10 min取样测定噬菌体效价。
27.结果显示，该噬菌体感染宿主的潜伏期为40 min，裂解期为80 min，裂解量为190 pfu/cell，裂解性强，结果见图2。
28.实施例3维氏气单胞菌噬菌体paev1818体外抑菌曲线测定本实施例在检测噬菌体体外裂解效率时，将moi值设为10，即噬菌体浓度高于对数期菌液浓度10倍，以提高不同处理组之间抑菌曲线差异。具体操作如下：培养宿主菌至10
8 cfu/ml，4℃、8000
ꢀ×ꢀ
g离心5min弃上清，沉淀用等体积lb培养基重悬；取96孔细胞培养板添加100 μl重悬液每孔，同时以强力霉素盐酸沙拉沙星（10 mg/l）作为阳性对照，没处理组设三个平行（n = 3）；空白对照组设置100 μl宿主菌悬浮液；分组好的细胞培养板统一静置放于酶标仪中培养，28℃震荡培养，每隔1h用酶标仪检测od
600
值，记录数据并用prism graphpad 5.0数据分析软件作图分析，结果见图3，噬菌体在体外可以有效地抑制维氏气单胞菌的生长。
29.实施例4维氏气单胞菌噬菌体paev1818防控由维氏气单胞菌弧菌引起的鲫鱼疾病应用效果分析（实验室水平）取购自盐城某鲫鱼养殖厂健康鲫鱼120尾，随机分成三组，每组10只并设置4个重复，攻毒方式采用浸浴处理，没养殖箱放置30l水。
30.第一组：阴性对照组，加入维氏气单胞菌至终浓度为105cfu/ml；第二组：阳性对照组，加入维氏气单胞菌至终浓度为105cfu/ml，3 h后加入盐酸沙拉沙星至终浓度10 mg/l；第三组：噬菌体实验组，加入维氏气单胞菌至终浓度为105cfu/ml，3 h后加入至噬菌体终浓度为106cfu/ml（moi=10）。
31.观察各组鲫鱼的生存状态，统计存活率，对照组患病鲫鱼结果如附图4所示，肠道肿胀充血，鳃部出血。结果表明尽管噬菌体处理组鲫鱼存活率显著低于抗生素处理组（p 《0.05），但相对于阴性对照组，噬菌体可有效提高受感染鲫鱼的存活率（p 《0.05），见附图5。
32.实施例5nacl-peg方法纯化噬菌体裂解液（10
10
pfu/ml），50 l发酵罐扩大培养，板式过滤器并0.22μm滤膜过滤，收集滤液于30 l塑料桶中（108pfu/ml）。在放苗期（5月-6月），进行大水体放养时，将鲫鱼浸浴所述噬菌体的悬浮液中，施用量≥108pfu/l水体，或将所述噬菌体悬浮液稀释后对养殖池进行喷洒，每隔10天喷洒1次，连续进行3次，每次施用量≥105pfu/m3养殖水体。具体实施细节如下：实验场地：盐城某农业发展有限公司时间：2021.5.16-2021.6.20鲫鱼规格：平均体重12
±
1.6 g健康鲫鱼养殖池分组：对照池和实验池各1池，占地5亩维氏气单胞菌噬菌体paev1818产品：每次投放鱼苗时采用噬菌体悬浮液进行浸浴。
33.养殖条件：水温控制20-28℃，ph 为7.3-7.6；实验过程养殖池采用24 h曝气，每天投喂饲料一次。
34.实验取样：养殖30天后，在对照池和实验池中各随机取鲫鱼30条进行增重、摄食率计算，考察鲫鱼生长指标。
35.噬菌体悬浮液初步应用结果统计如下表1所示，表1 噬菌体处理后鲫鱼部分生长性能指标变化由表1可以看出，浸浴本发明所述噬菌体悬浮液，可有效提高鲫鱼生长性能，其中养殖一个月总增重率实验池超过对照池14个百分点，个体摄食率也显著提高。