一种天瓜内生菌转化生产葫芦素E的方法与流程

一种天瓜内生菌转化生产葫芦素e的方法
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，涉及一种天瓜内生菌转化生产葫芦素e的方法。


背景技术：

2.天瓜是指葫芦科西瓜属带有苦味的西瓜品种,如药西瓜拉丁名(citrullus colocynthis)。原产于地中海地区,在我国主要分布在新疆等地,是维吾尔族习用药材,收载于我国一九九八年卫生部颁药材标准维吾尔分册中。天瓜味苦，性寒，入脾、胃经，主要适用于由寒气所引起的各种疾病,缓解疼痛,通气,消肿止痛。
3.天瓜果实和根中含有多种葫芦素成分,其中以葫芦素及其单葡萄糖苷含量最高。葫芦素是一类高度氧化的葫芦烷型四环三萜烯类物质，至今已发现40多种，其中以葫芦素b和e应用最广。葫芦素e具有抗肿瘤、抗化学致癌、增强机体免疫力的作用，目前临床用于慢性肝炎和原发性肝癌的辅助治疗。
4.甜瓜蒂提取的总葫芦素中存在葫芦素e的糖苷，其含量接近甚至大于葫芦素e的含量，但生物活性远远不如葫芦素e。天瓜提取物中活性成分大多为糖苷键连接的化合物，由于人体缺乏相应的酶，不能将其水解为苷元进而吸收利用。因此，为了提高天瓜的食用和药用价值，需要开发一条生物转化葫芦素e葡萄糖苷制备葫芦素e的工艺具有潜在的应用价值。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种天瓜内生菌转化生产葫芦素e的方法。
6.为实现上述目的，本发明提供的一种天瓜内生菌转化生产葫芦素e的方法包括以下步骤：
7.1.天瓜瓜蒂提取物制备
8.取天瓜瓜蒂于80℃烘干12h，粉碎后过100目筛，加入20-50倍量(m/v)的70％乙醇，40℃水浴浸提2.5h，再超声提取0.5h，离心取上清液，上清液减压蒸干后用5-10倍量(m/v)的甲醇溶解，经孔径0.22μm有机滤膜过滤，得到天瓜瓜蒂提取物。
9.2.固体培养基的配制
10.取土豆200g切成块放入锅中，加水至1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持30min，过滤，弃滤渣。滤液中加入蔗糖20g，碳酸钙2-4g及琼脂粉15-20g，补足水至1000ml，121℃高压蒸汽灭菌20min得到固体培养基。
11.3.液体培养基的配制
12.配制葡萄糖1％、豆粕0.5％、酵母提取物0.5％、氯化钠0.5％、磷酸氢二钾0.5％的培养基，向其中加入碳酸钙2-4g，补足水至1000ml，得到液体培养基。
13.4.天瓜内生菌f1的培养
14.取天瓜内生菌打成菌饼块，所述的天瓜内生菌为腐皮镰孢菌(fusarium solani(mart.))，将菌饼接种于固体培养基平板的中心，28℃培养，6-9天后刮取平板上的菌丝移
到100ml液体培养基的三角瓶中，28℃、120r/min往复摇床培养8-10天，得到天瓜内生菌f1的培养液。
15.5.葫芦素e葡萄糖苷转化方法
16.向含有天瓜内生菌f1的培养液的三角瓶中加入已灭菌的玻璃珠，再将该三角瓶放在摇床中，180rpm室温振荡1-2h，在无菌环境下过滤菌液，此菌液含有孢子；先将含有孢子的菌液按上述振荡条件下培养24h后，加入天瓜瓜蒂提取物，最后使天瓜内生菌f1菌液的孢子最终浓度为3-5
×
106cfu/ml，继续振荡培养1-2天，得到稀有葫芦素e。
17.本发明的最佳方法如下：
18.1.天瓜瓜蒂提取物制备
19.取天瓜瓜蒂于80℃烘干12h，粉碎后过100目筛，加入20倍量(m/v)的70％乙醇，40℃水浴浸提2.5h，再超声提取0.5h，离心取上清液，上清液减压蒸干后用5倍量(m/v)的甲醇溶解，经孔径0.22μm有机滤膜过滤，得到天瓜瓜蒂提取物。
20.2.固体培养基的配制
21.取土豆200g切成块放入锅中，加水至1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持30min，过滤，弃滤渣。滤液中加入蔗糖20g，碳酸钙2g及琼脂粉18g，补足水至1000ml，121℃高压蒸汽灭菌20min得到固体培养基。
22.3.液体培养基的配制
23.配制葡萄糖1％、豆粕0.5％、酵母提取物0.5％、氯化钠0.5％、磷酸氢二钾0.5％的培养基，向其中加入碳酸钙2g，补足水至1000ml，得到液体培养基。
24.4.天瓜内生菌f1的培养
25.取天瓜内生菌打成菌饼块，所述的天瓜内生菌为腐皮镰孢菌(fusarium solani(mart.))，将菌饼接种于固体培养基平板的中心，28℃培养，6天后刮取平板上的菌丝移到100ml液体培养基的三角瓶中，28℃、120r/min往复摇床培养8天，得到天瓜内生菌f1的培养液。
26.5.葫芦素e葡萄糖苷转化方法
27.向含有天瓜内生菌f1的培养液的三角瓶中加入已灭菌的玻璃珠，再将该三角瓶放在摇床中，180rpm室温振荡2h，在无菌环境下过滤菌液，此菌液含有孢子；先将含有孢子的菌液按上述振荡条件下培养24h后，加入天瓜瓜蒂提取物，最后使天瓜内生菌f1菌液的孢子最终浓度为3-5
×
106cfu/ml，继续振荡培养1.5天，得到稀有葫芦素e。
28.hplc法检测葫芦素e葡萄糖苷转化为葫芦素e的色谱条件
29.该高像液相色谱柱为eclipse xdb-c18(4.6mm
×
250mm，5μm)，柱温35℃，流动相甲醇-水(60:40，v/v)，体积流量1.0ml/min，检测波长230nm，进样量15μl，葫芦素e葡萄糖苷收集保留时间为8.6min左右的流出峰，葫芦素e收集保留时间为12.0min左右的流出峰。
30.葫芦素e葡萄糖苷转化为葫芦素e的结果分析
31.天瓜内生菌(fusarium solani(mart.))转化葫芦素e结果如图1所示，在最佳转化工艺条件下，葫芦素e葡萄糖苷转化为葫芦素e的最高转化率达到73％。
32.本发明采用天瓜内生菌转化生产稀有葫芦素e，内生菌生长周期短、生长迅速，易于培养而不受环境因素影响，适宜工业化生产。
附图说明
33.图1为天瓜瓜蒂提取物经最佳转化工艺后，葫芦素e葡萄糖苷转化hplc图；
34.图2为未加入天瓜内生菌条件下，天瓜瓜蒂提取物中葫芦素e葡萄糖苷和葫芦素e的hplc图。
具体实施方式
35.以下结合实例对本发明作进一步说明，但本发明的实施方式不限于此。
36.实施例1
37.一种天瓜内生菌转化生产葫芦素e的方法，包括以下步骤：
38.1.天瓜瓜蒂提取物制备
39.取天瓜瓜蒂于80℃烘干12h，粉碎后过100目筛，加入20倍量(m/v)的70％乙醇，40℃水浴浸提2.5h，再超声提取0.5h，离心取上清液，上清液减压蒸干后用10倍量(m/v)的甲醇溶解，经孔径0.22μm有机滤膜过滤，得到天瓜瓜蒂提取物。
40.2.固体培养基的配制
41.取土豆200g切成块放入锅中，加水至1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持30min，过滤，弃滤渣。滤液中加入蔗糖20g，碳酸钙3g及琼脂粉18g，补足水至1000ml，121℃高压蒸汽灭菌20min得到固体培养基。
42.3.液体培养基的配制
43.配制葡萄糖1％、豆粕0.5％、酵母提取物0.5％、氯化钠0.5％、磷酸氢二钾0.5％的培养基，向其中加入碳酸钙3g，补足水至1000ml，得到液体培养基。
44.4.天瓜内生菌f1的培养
45.取天瓜内生菌打成菌饼块，所述的天瓜内生菌为腐皮镰孢菌(fusarium solani(mart.))，将菌饼接种于固体培养基平板的中心，28℃培养，8天后刮取平板上的菌丝移到100ml液体培养基的三角瓶中，28℃、120r/min往复摇床培养10天，得到天瓜内生菌f1的培养液；
46.5.葫芦素e葡萄糖苷转化方法
47.向含有天瓜内生菌f1的培养液的三角瓶中加入已灭菌的玻璃珠，再将该三角瓶放在摇床中，180rpm室温振荡2h，在无菌环境下过滤菌液，此菌液含有孢子；先将含有孢子的菌液按上述振荡条件下培养24h后，加入天瓜瓜蒂提取物，最后使天瓜内生菌f1菌液的孢子最终浓度为3-5
×
106cfu/ml，继续振荡培养1天，得到稀有葫芦素e。
48.实施例2
49.一种天瓜内生菌转化生产葫芦素e的方法，包括以下步骤：
50.1.天瓜瓜蒂提取物制备
51.取天瓜瓜蒂于80℃烘干12h，粉碎后过100目筛，加入20倍量(m/v)的70％乙醇，40℃水浴浸提2.5h，再超声提取0.5h，离心取上清液，上清液减压蒸干后用5倍量(m/v)的甲醇溶解，经孔径0.22μm有机滤膜过滤，得到天瓜瓜蒂提取物。
52.2.固体培养基的配制
53.取土豆200g切成块放入锅中，加水至1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持30min，过滤，弃滤渣。滤液中加入蔗糖20g，碳酸钙2g及琼脂粉18g，补足水至1000ml，121℃高压蒸
汽灭菌20min得到固体培养基。
54.3.液体培养基的配制
55.配制葡萄糖1％、豆粕0.5％、酵母提取物0.5％、氯化钠0.5％、磷酸氢二钾0.5％的培养基，向其中加入碳酸钙2g，补足水至1000ml，得到液体培养基。
56.4.天瓜内生菌f1的培养
57.取天瓜内生菌打成菌饼块，所述的天瓜内生菌为腐皮镰孢菌(fusarium solani(mart.))，将菌饼接种于固体培养基平板的中心，28℃培养，6天后刮取平板上的菌丝移到100ml液体培养基的三角瓶中，28℃、120r/min往复摇床培养8天，得到天瓜内生菌f1的培养液。
58.5.葫芦素e葡萄糖苷转化方法
59.向含有天瓜内生菌f1的培养液的三角瓶中加入已灭菌的玻璃珠，再将该三角瓶放在摇床中，180rpm室温振荡2h，在无菌环境下过滤菌液，此菌液含有孢子；先将含有孢子的菌液按上述振荡条件下培养24h后，加入天瓜瓜蒂提取物，最后使天瓜内生菌f1菌液的孢子最终浓度为3-5
×
106cfu/ml，继续振荡培养1.5天，得到稀有葫芦素e。
60.实施例3
61.一种天瓜内生菌转化生产葫芦素e的方法，包括以下步骤：
62.1.天瓜瓜蒂提取物制备
63.取天瓜瓜蒂于80℃烘干12h，粉碎后过100目筛，加入50倍量(m/v)的70％乙醇，40℃水浴浸提2.5h，再超声提取0.5h，离心取上清液，上清液减压蒸干后用10倍量(m/v)的甲醇溶解，经孔径0.22μm有机滤膜过滤，得到天瓜瓜蒂提取物。
64.2.固体培养基的配制
65.取土豆200g切成块放入锅中，加水至1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持30min，过滤，弃滤渣。滤液中加入蔗糖20g，碳酸钙4g及琼脂粉18g，补足水至1000ml，121℃高压蒸汽灭菌20min得到固体培养基。
66.3.液体培养基的配制
67.配制葡萄糖1％、豆粕0.5％、酵母提取物0.5％、氯化钠0.5％、磷酸氢二钾0.5％的培养基，向其中加入碳酸钙4g，补足水至1000ml，得到液体培养基。
68.4.天瓜内生菌f1的培养
69.取天瓜内生菌打成菌饼块，所述的天瓜内生菌为腐皮镰孢菌(fusarium solani(mart.))，将菌饼接种于固体培养基平板的中心，28℃培养，9天后刮取平板上的菌丝移到100ml液体培养基的三角瓶中，28℃、120r/min往复摇床培养8天，得到天瓜内生菌f1的培养液。
70.5.葫芦素e葡萄糖苷转化方法
71.向含有天瓜内生菌f1的培养液的三角瓶中加入已灭菌的玻璃珠，再将该三角瓶放在摇床中，180rpm室温振荡2h，在无菌环境下过滤菌液，此菌液含有孢子；先将含有孢子的菌液按上述振荡条件下培养24h后，加入天瓜瓜蒂提取物，最后使天瓜内生菌f1菌液的孢子最终浓度为3-5
×
106cfu/ml，继续振荡培养2天，得到稀有葫芦素e。
72.上述实施例所测葫芦素摩尔产率见表1：
73.表1
[0074][0075][0076]
由以上结果可得，经天瓜瓜蒂提取物经天瓜内生菌发酵后，其活性成分葫芦素e产率显著提高。
[0077]
上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明保护范围的限制，但凡采用本发明的设计原理，以及在此基础上进行非创造性劳动而作出的变化，均属于本发明的保护范围之内。