一种促进细胞铁死亡的基因的功能确定及应用

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种促进细胞铁死亡的基因的功能确定及应用。

背景技术：

1、铁死亡(ferroptosis)是一种铁离子依赖性脂质过氧化物累积导致细胞死亡的方式。其作用涉及到发育、衰老、免疫和癌症等广泛的生物学过程。目前已确定的诱导铁死亡的机制有四种：(1)抑制systemxc；(2)抑制、降解或失活gpx4蛋白；(3)减少coq10；(4)通过过氧化物、铁或多不饱和脂肪酸过载诱导脂质过氧化。尽管铁对细胞的生长存在起重要作用，但是过量铁会产生活性氧(ros)，从而对细胞产生毒害作用，甚至会导致细胞死亡。铁死亡参与神经元中铁依赖性氧化细胞死亡形式。铁死亡的发现与研究，为多种神经疾病提供新的有前途的治疗方向以及为癌症治疗提供新型靶点，如多种神经类疾病如阿尔茨海默病(alzheimer's disease，ad)、帕金森病(parkinson's disease，pd)、亨廷顿舞蹈病(huntington's disease，hd)。一般来说，旨在抑制铁死亡信号和途径的治疗策略也对铁过载疾病起作用。比如，通过使用螯合剂去除铁是一种更有效靶向铁的方法，因为它剥夺了癌细胞快速生长所需的铁，但是这种方式对正常细胞也具有强大杀伤力，对人体也存在严重的对人体也存在严重的副作用。

2、目前的研究中，一些蛋白被证实参与铁死亡的调控，包括谷胱甘肽过氧化物酶4(gpx4)、铁死亡抑制蛋白(fsp1)、二氢乳清酸脱氢酶(dhodh)，这些蛋白集中在维持细胞内氧化还原处于平衡状态，从而抑制细胞铁死亡。虽然对铁死亡的调控有越来越深入的研究，但是这些研究远远还不够。

3、n-乙酰化α-连接酸性二肽酶2(n-acetylated alpha-linked acidicdipeptidase 2，naalad2)，也被称为谷氨酸羧肽酶iii(glutamate carboxypeptidaseiii，gcp iii)，是一种双核锌金属肽酶，其mrna在人中枢神经，肾上腺，子宫和睾丸中大量表达。naalad2属于ii型跨膜糖蛋白，由较短的胞内结构域(1-8aa)，跨膜结构域(9-31aa)和具有羧肽酶活性的胞外结构域构成。naalad2可zn2+,mn2+依赖性水解神经肽n-乙酰天冬氨酰谷氨酸(n-acetylaspartylglutamate，naag)，催化效率约为于其高度同源蛋白谷氨酸羧肽酶ii(glutamate carboxypeptidase ii，gcp ii)的十分之一。在gcp ii敲除小鼠大脑中观察到naalad2的naag水解活性提高，故naalad2曾被认为是gcp ii的潜在互补酶。2011年，collard等发现β-柠檬酰谷氨酸水解酶与naalad2在酶促动力学特征，组织分布等方面存在极高的一致性，且纯化的β-柠檬酰谷氨酸水解酶中存在naalad2，由此将β-柠檬酰谷氨酸(β-citrylglutamate，bcg)的水解酶鉴定为naalad2。navrátil等通过量子力学/分子力学模型计算(qm/mm calculations)对naalad2/bcg复合物进行建模，提示naalad2通过ser444、arg524和arg526与bcg中柠檬酸盐配位而进行结合。该研究还指出naalad2水解bcg的过程是ca2+，mn2+依赖性的。bcg是一种假二肽，其具体功能未知，可能在中枢神经系统和生殖系统中发挥作用，bcg的铁螯合物可通过顺乌头酸酶促进神经元细胞生存。除此之外，naalad2还可作为多种疾病的特征基因，在癌症中，naalad2启动子甲基化被鉴定为前列腺癌的标志之一，naalad2 circrna在神经母细胞瘤中显著下调，且与乳酸脱氢酶浓度相关；在其他疾病中，naalad2还是股骨头坏死的易感基因，糖尿病引发痴呆的因果基因。在白细胞计数中，naalad2是嗜碱性粒细胞的特征基因座；但naalad2与铁死亡的关系迄今尚未见任何报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供naalad2在促进细胞铁死亡中的应用。

2、本发明所采取的技术方案是：

3、本发明的第一方面，提供检测naalad2表达量的物质在(a1)～(c1)中的应用：

4、(a1)制备评估肿瘤细胞对铁死亡的敏感性的产品；

5、(b1)制备预测或辅助预测肿瘤预后的产品；

6、(c1)制备预测或辅助预测癌症患者的总生存期的产品。

7、在本发明的一些实施方式中，所述产品包括试剂盒、诊断试剂、检测试剂、试纸、基因芯片或蛋白质芯片。

8、在本发明的一些实施方式中，所述物质包括在基因或蛋白水平上定量检测naalad2的物质。

9、在本发明的一些实施方式中，所述在基因水平上定量检测naalad2的物质包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术或免疫测定的方法检测标志物基因表达水平的物质。

10、在本发明的一些实施方式中，所述在蛋白水平上定量检测naalad2的物质包括免疫组化、蛋白免疫印迹、酶联免疫吸附(elisa)、流式细胞术、化学发光、电化学、紫外分光光度法-近红外光谱法、液相芯片法、高效液相色谱法、比色法或质谱鉴定的方法检测蛋白表达水平的物质。

11、在本发明的一些实施方式中，所述物质包括试剂和/或仪器。

12、在本发明的一些事实方式中，所述物质包括：抗体、引物、探针。

13、本发明的第二方面，提供naalad2在(a2)～(e2)至少一种中的应用；

14、(a2)调控肿瘤细胞铁死亡；

15、(b2)制备调控肿瘤细胞铁死亡的产品

16、(c2)调控肿瘤细胞对铁死亡的敏感性；

17、(d2)制备调控肿瘤细胞对铁死亡的敏感性的产品；

18、(e2)制备治疗铁死亡相关疾病的药物。

19、在本发明的一些实施方式中，所述调控为提高或降低。

20、在本发明的一些实施方式中，所述产品包括药物或试剂。

21、在本发明的一些实施方式中，所述铁死亡相关疾病包括抑制铁死亡可治疗的相关疾病或诱导铁死亡可治疗的相关疾病。因为铁死亡在不同的疾病背景下扮演不同角色，本发明可以通过调控铁死亡进而得到治疗不同疾病的作用。

22、在本发明的一些实施方式中，所述诱导铁死亡可治疗的相关疾病包括：肿瘤；所述抑制铁死亡可治疗的相关的疾病包括：神经系统疾病、缺血再灌注损伤、急性肾衰竭、铁代谢相关疾病。

23、在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤包括：乳腺癌、食管癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、弥漫性大b细胞淋巴瘤、甲状腺癌、低级别胶质瘤。

24、在本发明的一些实施方式中，所述神经系统疾病包括帕金森病、阿尔兹海默症、脑室周围白质软化症、亨廷顿病、癫痫、运动神经衰退症、肌萎缩侧索硬化。

25、在本发明的一些实施方式中，所述缺血再灌注损伤包括心肌缺血再灌注损伤、肝缺血再灌注损伤或肾缺血再灌注损伤。

26、在本发明的一些实施方式中，所述铁代谢相关疾病包括动脉粥样硬化或糖尿病。

27、在本发明的一些实施方式中，心脑血管疾病包括：中风、脑出血、外伤性脑损伤、心脏疾病。

28、但不局限于上述疾病种类。

29、本发明的第三方面，提供naalad2抑制剂在(a3)～(e3)至少一种中的应用；

30、(a3)抑制肿瘤细胞铁死亡；

31、(b3)制备抑制肿瘤细胞铁死亡的产品；

32、(c3)降低肿瘤细胞对铁死亡的敏感性；

33、(d3)制备降低肿瘤细胞对铁死亡的敏感性的产品；

34、(e3)制备治疗铁死亡诱导的相关疾病的药物。

35、在本发明的一些实施方式中，所述naalad2抑制剂包括(a4)～(e4)中的至少一种：

36、(a4)抑制naalad2活性的物质；

37、(b4)降低naalad2含量的物质；

38、(c4)沉默naalad2基因的物质；

39、(d4)敲低naalad2基因的物质；

40、(e4)抑制naalad2基因表达的物质。

41、在本发明的一些优选实施方式中，所述naalad2抑制剂包括：化合物、sirna、sgrna、shrna、microrna、反义核酸、抗体的构建物中的至少一种。

42、在本发明的一些实施方式中，所述sgrna的序列包括sgrna1或sgrna2：

43、所述sgrna1的序列为：

44、sgrna1-f：caccggagatgggcatcaactgtac；

45、sgrna1-r：aaacgtacagttgatgcccatctcc；

46、所述sgrna2的序列为：

47、sgrna2-f：caccggtatcggacctggctttaca；

48、sgrna2-r：aaactgtaaagccaggtccgatacc。

49、在本发明的一些实施方式中，所述产品包括药物或试剂。

50、在本发明的一些所述肿瘤包括：乳腺癌、食管癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、弥漫性大b细胞淋巴瘤、甲状腺癌、低级别胶质瘤。

51、本发明的第五方面，提供naalad2激活剂在(a5)～(e5)至少一项中的应用；

52、(a5)促进肿瘤细胞铁死亡；

53、(b5)制备促进肿瘤细胞铁死亡；

54、(c5)提高肿瘤细胞对铁死亡的敏感性；

55、(d5)制备提高肿瘤细胞对铁死亡的敏感性的产品；

56、(e5)制备治疗铁死亡抑制的相关疾病的药物。

57、在本发明的一些实施方式中，所述naalad2激活剂包括naalad2蛋白或与naalad2相关的生物材料，所述生物材料为下述(a6)～(d6)中的任一种：

58、(a6)编码所述naalad2的核酸分子；

59、(b6)含有(a6)所述核酸分子的表达盒；

60、(c6)含有(a6)所述核酸分子的重组载体、或含有(b6)所述表达盒的重组载体；

61、(d6)含有(a6)所述核酸分子的重组细胞、或含有(b6)所述表达盒的重组细胞、或含有(c6)所述重组载体的重组细胞。

62、在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤包括：乳腺癌、食管癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、弥漫性大b细胞淋巴瘤、甲状腺癌、低级别胶质瘤。

63、本发明的第六方面，提供一种naalad2抑制剂，所述抑制剂包含sgrna或包含所述sgrna的重组载体、转基因细胞或重组菌；所述sgrna的序列包括sgrna1或sgrna2：

64、所述sgrna1的序列为：

65、sgrna1-f：caccggagatgggcatcaactgtac；

66、sgrna1-r：aaacgtacagttgatgcccatctcc；

67、所述sgrna2的序列为：

68、sgrna2-f：caccggtatcggacctggctttaca；

69、sgrna2-r：aaactgtaaagccaggtccgatacc。

70、本发明的第七方面，提供一种naalad2激活剂，所述激活剂包含由如seq id no.1所示引物和如seq id no.2所示的引物合成的dna核苷酸序列的重组载体、转基因细胞或重组菌。

71、本发明的第八方面，提供一种产品，所述产品包含本发明第六方面所述的naalad2抑制剂或本发明第七方面所述的naalad2激活剂。

72、本发明的有益效果是：

73、本发明发现naalad2是一种促进铁死亡的基因，实验数据显示，敲除naalad2后，人纤维肉瘤细胞ht-1080对铁死亡诱导剂erastin诱导的铁死亡有抵抗作用，过表达naalad2后，ht-1080对铁死亡诱导剂诱导的铁死亡有促进作用。因此可以通过调控naalad2的表达来达到抑制或促进铁死亡的效果，可以用于制备治疗肿瘤、神经系统疾病等常见的与铁死亡相关疾病的药物，也可以将naalad2基因作为研究铁死亡发生和发展的新机制，因此，本发明为铁死亡发生和发展研究中提供新的可能机制，也为铁死亡疾病的相关药物的开发提供了新的靶点及治疗依据，具有较高的应用价值。

74、而且本发明还发现在肝癌、脑低级别胶质瘤、甲状腺癌中naalad2高表达与低表达患者的生存曲线差别均有统计高表达与低表达患者的生存曲线差别均有统计学意义；因此naalad2也可以作为肿瘤患者的预后评估标志物，可以用于开发为新的肿瘤检测标志物诊断试剂盒，用于预后判断，具有很好的应用前景。