用于变体检测的方法与流程

本发明可用来提供一种检测dna中的变体诸如单核苷酸多态性(snp)、多核苷酸多肽性(mnp)和插入/缺失的更有效和不太易错的方法。本发明还提供了一种用于进行便宜的多色测定的方法，并且提供了用于在二维图中可视化多个等位基因结果的方法。

背景技术：

1、rna酶h2依赖的pcr(rhpcr)(参见美国专利申请公开号us 2009/0325169 a1，通过提及以其整体并入)和标准等位基因特异性pcr(aspcr)均可用于突变检测。在aspcr中，dna聚合酶通过检测在引物的3’端或3’端附近的错配进行错配辨别。虽然aspcr在错配检测中有时是成功的，但是由于野生型dna聚合酶的低错配检测能力，辨别可能受限。

2、与aspcr相反，rhpcr中的rna酶h2酶的错配灵敏度允许灵敏地检测dna突变和从反应中消除引物-二聚体人工生成物。然而，当试图用rhpcr检测dna突变时，引物内部的错配的定位是重要的。错配的位置越接近可切割的rna，可从rna酶h2酶观察到辨别越多，并且所得rhpcr测定的辨别越大。鉴于最常见的野生型dna聚合酶诸如taq经常显示出低水平的错配检测，在rna酶h2切割后不能仅依赖该聚合酶进行该辨别。结合标准rhpcr的每个循环所需要的重复询问，当利用这些聚合酶时，不希望将错配放置在除了与rna恰好相反之外的任何位置。

技术实现思路

1、本公开提供了利用高辨别聚合酶(high discrimination polymerase)突变体或其它高错配辨别聚合酶的测定，以创造可利用位于rna的5’的错配的新的测定设计。

2、本发明可用来提供一种检测dna中的突变(诸如snp和插入/缺失)的更有效和不太易错的方法。本发明还提供了一种用于进行便宜的多色测定的方法。

3、本发明的这些和其他优势以及另外的发明特征将从本文提供的本发明的描述中显而易见。

技术特征：

1.一种用于rhpcr的封闭-可切割的引物，所述引物包含：

2.权利要求1的引物，其中，d包含1-3个rna碱基。

3.权利要求1的引物，其中，d包含1个rna碱基。

4.权利要求1的引物，其中，所述可切割结构域包含以下部分中的一个或多个：dna残基、脱碱基残基、修饰的核苷或修饰的磷酸核苷酸间连接。

5.权利要求4的引物，其中，侧接所述切割位点的序列含有抗核酸酶切割的一个或多个核苷酸间连接。

6.权利要求5的引物，其中，所述核酸酶抗性连接为硫代磷酸酯。

7.权利要求2的引物，其中，所述rna残基的至少一个的3′氧原子被氨基、巯基或亚甲基取代。

8.权利要求1的引物，其中，所述封闭基团与所述引物的3′-末端核苷酸附接。

9.权利要求1的引物，其中，a包含与通用正向引物相同的区域以及任选的探针结合结构域。

10.一种从等位基因扩增图可视化多个不同荧光信号的方法，所述方法包括：

技术总结
本发明可用来提供检测DNA中的变体诸如SNP和插入/缺失的更有效和不太易错的方法。本发明还提供了用于进行便宜的多重测定的方法。

技术研发人员：J·多博希,S·罗斯,包赟,王彧,陈才夫,M·A·贝尔克,P·W·曾,K·贝尔茨,G·雷蒂希
受保护的技术使用者：综合基因技术公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12