检测新型冠状病毒的引物组及恒温检测试剂盒的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及检测新型冠状病毒的引物组及恒温检测试剂盒。


背景技术：

2.新型冠状病毒(sars-cov-2)的检测主要依靠医学影像学及分子生物学，在分子生物学检测方面又大致分为病毒分离培养、抗原/抗体检测与核酸检测三大类。核酸作为sars-cov-2目前主要的检测手段，广泛应用于疑似病人的筛查、治愈的情况的核实以及环境监测站。
3.目前应用最多的核酸检测方法为荧光定量探针法，如公告号为cn112159868b的中国发明专利所指出，使用荧光定量pcr仪实时采集核酸探针在dna合成过程中被切割产生的荧光信号，具有高灵敏度、高特异性的特点，但对设备要求高、操作相对复杂，这对基层单位的推广使用造成了较大的障碍，不适宜现场快速检测，尤其难以应对突发公共卫生事件。另外，作为核酸检测的补充手段，免疫学检测方法也有所应用，但免疫学检测方法需要在患者被感染1-2周后，方可检测出患者体内的抗原/抗体，此类方法具有一定的滞后性，难以达到早期诊断、人群筛查的目的。
4.为了进一步提高核酸检测水平，实现更加方便、快捷的核酸检测，各类等温扩增技术正日益受到大家的关注，其应用范围不断拓展。一方面，等温扩增一般借助恒温反应模式来实现核酸扩增，由此显著降低了装置复杂度；另一方面，等温扩增通过多个反应酶的相互作用来引导核酸扩增，省略了pcr的反复升降温过程，由此显著缩短了核酸检测时间。


技术实现要素：

5.为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种检测新型冠状病毒的引物组及恒温检测试剂盒，该方法特异性强，灵敏度高，检测时间短，该检测试剂盒是以非诊断为目的的。
6.为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种检测新型冠状病毒的引物组，其特征在于，所述引物组由seq id no:1～seq id no:6所示的6条引物组成(见表1)。
7.表1
[0008][0009]
本发明的另一技术方案为：一种检测新型冠状病毒的恒温检测试剂盒，其特征在于，包括扩增体系，所述扩增体系包括上述的引物组。
[0010]
本发明的有益效果在于：本发明建立了一种基于可视化rt-lamp扩增技术，将病毒rna的目标序列通过lamp进行指数扩增，应用于新型冠状病毒的检测。以sars-cov-2的n基因为模板进行lamp引物设计，设计的引物序列包括一对内引物(fip和bip)，一对外引物(f3和b3)和一对环引物(lf和lb)6条引物共靶向n基因的8个基因位点。可视化检测时，通过lamp扩增过程中产生的h
+
离子，可对病毒进行终点的定性检测。
附图说明
[0011]
图1所示为本发明的具体实施方式的微流控芯片的结构示意图；
[0012]
标号说明：1、生物芯片本体；2、注样口；3、y形管道；31、主管道；32、支管；4、细管道；5、反应腔；6、出气孔。
具体实施方式
[0013]
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
[0014]
本发明最关键的构思在于：建立了一种基于可视化rt-lamp扩增技术，将病毒rna的目标序列通过lamp进行指数扩增，应用于新型冠状病毒的检测。可视化检测时，通过lamp扩增过程中产生的h
+
离子，可对病毒进行终点的定性检测。
[0015]
本发明的一种检测新型冠状病毒的引物组，引物组由seq id no:1～seq id no:6所示的6条引物组成。
[0016]
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明的恒温检测试剂盒可对新型冠状病毒进行检测。本发明以sars-cov-2的n基因为模板进行lamp引物设计，设计的引物序列包括一对内引物(fip和bip)，一对外引物(f3和b3)和一对环引物(lf和lb)6条引物共靶向n基因的8个基因位点。
[0017]
进一步地，引物组中的引物含量见表2。
[0018]
表2
[0019]
引物名称浓度25μl扩增体系加入量(μl)fip100μm1.0～2.0bip100μm1.0～2.0f3100μm0.5～1.0b3100μm0.5～1.0lf100μm0.5～1.0lb100μm0.5～1.0
[0020]
从上述描述可知，上述的配比为特定配比，引物含量和配比的变化会影响反应体系的特异性，可能产生引物二聚体。
[0021]
本发明的另一技术方案为：一种检测新型冠状病毒的恒温检测试剂盒，包括扩增体系，扩增体系包括上述引物组。
[0022]
进一步地，扩增体系还包括5x buffer、染料、脱氧核糖核苷三磷酸、bst dna聚合酶、逆转录酶和rna抑制剂。
[0023]
从上述描述可知，lamp(loop-mediated isothermal amplification)扩增技术是一种灵敏的恒温核酸扩增方法，它利用具有链置换活性的bst dna聚合酶，使用针对待扩增区域6个位点设计的4-6条引物进行dna扩增。rt-lamp是在lamp的基础上加入了逆转录酶，可以将rna反转录成cdna后直接扩增，从而将模板范围从dna扩展到了rna。lamp、rt-lamp技术具有对设备要求低、特异性较高、操作简单(提供60℃-65℃恒温即可)的优点。
[0024]
采用5x buffer相比常见的2x buffer而言，加入到冻干体系中的固形物含量更高，可以缩短后续扩增体系的冻干时间，且冻干后试剂的稳定性的更好。本发明的反应体系中使用的酶性能稳定，效价高，加入到反应体系中冻干前后，酶活力无明显损失；冻干后酶在体系中的状态为干粉状态，空间构象稳定，不容易变化，因此在常温的状态下也可以保持活力。
[0025]
进一步地，扩增体系的组分含量见表3。
[0026]
表3
[0027]
组分浓度25μl体系加入量(μl)5x buffer/5.0染料50～100mm0.5～5脱氧核糖核苷三磷酸25mm1.0～5.0引物组/4.0～8.0bst dna聚合酶8u/μl1.0～2.0逆转录酶200u/μl0.1～1.0rna抑制剂40u/μl0.1～2.0nf水/余量
[0028]
从上述描述可知，5x buffer和bstdna聚合酶的含量偏多或偏少都会影响扩增效率，可能导致体系不扩增；染料的含量偏多或偏少会影响体系的颜色，使体系反应前后颜色不变化或者变化不明显；脱氧核糖核甘三磷酸和引物组的含量偏多或偏少会导致体系不扩增或者出现非特异性扩增，产生引物二聚体等问题。rna抑制剂的含量偏多会抑制体系的扩
增，偏少易产生污染。
[0029]
进一步地，5x buffer包括kcl溶液、mg
2+
溶液tris-hcl溶液和吐温20。
[0030]
从上述描述可知，5x buffer以及扩增体系中的其他成分，均不含甘油，无需调整成分，可直接冻干。
[0031]
进一步地，5x buffer的组分含量见表4。
[0032]
表4
[0033]
从上述描述可知，氯化钾和镁离子的含量的偏多导致扩增效率降低，偏少抑制扩增，均会影响最终反应体系的扩增效率；tris-hcl溶液的含量影响体系颜色的变化。
[0034]
进一步地，tris-hcl溶液的ph为9.0。
[0035]
从上述描述可知，ph偏大会使体系反应前后颜色变化不明显，ph偏导致体系不变色。
[0036]
进一步地，染料包括质量分数为0.1％～0.5％的伊文思蓝和质量分数为0.1％～1％的酚红。
[0037]
从上述描述可知，使用伊文思蓝和酚红复合染料，阳性样本反应前的体系颜色为紫黑色，反应后的体系颜色为黄绿色，阴性样本反应前后体系的颜色均为紫黑色，反应后阴、阳性检测结果颜色区分明显，比常见的蓝色-紫色变色体系，或者基于钙黄绿素的变色体系的检测结果更加易于辨识，不容易产生误判，检测结果的灵敏度高。
[0038]
进一步地，还包括保护剂，保护剂包括质量分数为10％～15％的海藻糖、质量分数为5％～10％的bsa(牛血清白蛋白)和质量分数为10％～20％的甘露醇。
[0039]
从上述描述可知，在扩增体系内加入一定量的保护剂进行冻干，可减少酶活力损失，提高检测效率。
[0040]
进一步地，保护剂与扩增体系等体积混合。
[0041]
请参照图1所示，进一步地，上述恒温恒温检测试剂盒与微流控芯片联合使用，微流控芯片包括生物芯片本体，生物芯片本体上设有注样口，注样口连通y形管道的主管道，两条y形管道的支管分别连通一条细管道，细管道上设有反应腔，细管道的两端设有出气孔。
[0042]
从上述描述可知，绝大部份的微流体芯片直接将硬质芯片和流体导管进行胶粘，此方法很大程度上影响了芯片的固定和使用，且有可能造成污染，阻碍了微流控芯片的大规模使用。此外，目前微流控芯片受到芯片上试剂存储有效时长的影响，芯片能够稳定工作的使用寿命往往有限；芯片上的试剂存储与快速释放等功能会显著增加芯片的复杂度，提升了芯片的检测成本。
[0043]
本发明所述的微流控芯片是装有冻干试剂的检测芯片，芯片的材质采用亲水材料，芯片的反应腔中装有扩增体系的冻干球。在使用过程中，只需将待测样本通过注样口加入微流控芯片，并将芯片插入仪器，待测样本通过虹吸作用进入反应腔，无需借助其他外力，不需要采用注射泵；完成加样后，使用封膜将芯片封闭，插入仪器中进行反应；扩增反应过程中，探测器将接收到的荧光信号输入计算机，配套软件会将接收到的信号进行相应处理并绘制成实时曲线，检测完成后自动进行结果判读和显示。
[0044]
芯片的反应腔相互独立，防污染体系，交叉污染小。采用该微流控芯片实现了即时扩增，即时检测，无需提取。同时仪器小巧，重量轻，操作简单方便，即使在缺乏专业人员的情况下，依照说明书仍可在40min内对新型冠状病毒完成快速筛查，适用于现场检测，可以满足临床使用要求。
[0045]
请参照图1所示，本发明的实施例一为：
[0046]
本发明的一种检测新型冠状病毒的恒温检测试剂盒，包括扩增体系和保护剂，扩增体系包括引物组、5x buffer、染料、脱氧核糖核苷三磷酸、bst dna聚合酶、逆转录酶和rna抑制剂。5x buffer由kcl溶液、mg
2+
溶液tris-hcl溶液和吐温20组成。染料包括质量分数为0.1％的伊文思蓝和质量分数为0.1％的酚红。保护剂包括质量分数为10％的海藻糖、质量分数为5％的bsa(牛血清白蛋白)和质量分数为10％的甘露醇。保护剂与扩增体系等体积混合。
[0047]
引物组由seq id no:1～seq id no:6所示的6条引物组成；
[0048]
扩增体系的组分含量见表5。
[0049]
表5
[0050][0051]
表5中tris-hcl溶液加入量实际为0.8995μl，约为0.9μl。
[0052]
采用上述恒温检测试剂盒检测新型冠状病毒的检测方法，包括以下步骤：
[0053]
s1：采样：将拭子以垂直(面部)方向插入鼻腔2～5cm，使拭子在鼻内停留10～15s，每个鼻孔轻轻旋转3～5次，取出拭子；将采集后的鼻拭子在涮洗液中充分涮洗2～3次，涮洗后丢弃拭子，拧紧管盖；
[0054]
s2：打开涮洗液管顶部透明小管盖，使用移液器将400ul涮洗液从微流控芯片的注样口注入，样本溶液通过细管道进入加有冻干后的扩增体系的反应腔中，再用封膜将芯片封闭，插入仪器中进行反应；
[0055]
s3：反应结束后，仪器自动对结果进行判读，显示检测结果；
[0056]
s4：检测完成后，将芯片取出仪器，并按照医疗废弃物处理芯片和试剂。
[0057]
其中，微流控芯片包括生物芯片本体1，生物芯片本体1上设有注样口2，注样口连通y形管道3的主管道31，两条y形管道3的支管32分别连通一条细管道4，细管道上设有反应腔5，细管道的两端设有出气孔6。
[0058]
冻干扩增体系的冻干机的参数设置见表6和表7：
[0059]
表6
[0060]
区段运行时间结束温度
15时0分-50.0218时0分-50.031时0分-20.041时0分0.051时0分2064时0分30.0
[0061]
表7
[0062]
名称开始区段结束区段真空调节126
[0063]
本发明的实施例2为：
[0064]
实施例2与实施例1的区别在于：染料包括质量分数为0.5％的伊文思蓝和质量分数为1％的酚红。保护剂包括质量分数为15％的海藻糖、质量分数为10％的bsa(牛血清白蛋白)和质量分数为20％的甘露醇。
[0065]
扩增体系的组分含量见表7。
[0066]
表7
[0067][0068]
[0069]
表7中mg
2+
溶液加入量实际为0.9999μl，约为1.0μl。
[0070]
本发明的实施例3为：
[0071]
实施例3与实施例1的区别在于：染料包括质量分数为0.3％的伊文思蓝和质量分数为0.3％的酚红。保护剂包括质量分数为12％的海藻糖、质量分数为8％的bsa(牛血清白蛋白)和质量分数为15％的甘露醇。
[0072]
扩增体系的组分含量见表8。
[0073]
表8
[0074][0075][0076]
表8中kcl溶液加入量实际为2.4993μl，约为2.5μl。
[0077]
综上所述，本发明建立了一种基于可视化rt-lamp扩增技术、冻干技术与自吸离散式微流控芯片技术的快速检测方法，开发出更适用于基层单位或在突发公共卫生应急事件中方便使用的现场快速检测方法和对应的poct(即时检测)产品。该方法将病毒rna的目标序列通过lamp进行指数扩增，应用于新型冠状病毒的检测，有利于实现“样品入-结果出”封闭式自动化检测，显著提高检测效率，省去其他检测方法(如常规pcr法或常规lamp法)所必须的提取过程，大大缩短了总体检测时间，在40分钟内即可获取结果；也有利于实现高通量、并行、乃至多靶标多重检测，显著提升了整体检测水平。
[0078]
可视化rt-lamp检测通过在芯片反应腔内装载有扩增体系的冻干球，芯片封装后可常温2～30℃储存6个月，有效避免了试剂运输过程储存不当导致的试剂失效问题，降低了运输和储存的成本。冻干球内含针对新型冠状病毒的扩增检测组分，包括特异性引物、bst dna聚合酶、可视化复合染料等。可视化检测时，通过lamp扩增过程中产生的h
+
离子，可对病毒进行终点的定性检测，当检测为阳性时，扩增检测液的颜色将由紫黑色变为绿色；当检测为阴性或为未扩增的原始体系时，扩增检测液应为紫黑色。
[0079]
在使用过程中，只需将待测样本通过注样口加入微流控芯片，并将芯片插入仪器，待测样本通过虹吸作用进入反应腔，无需借助其他外力，不需要采用注射泵；完成加样后，使用封膜将芯片封闭，插入仪器中进行反应；扩增反应过程中，探测器将接收到的荧光信号输入计算机，配套软件会将接收到的信号进行相应处理并绘制成实时曲线，检测完成后自动进行结果判读和显示。
[0080]
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。