一种改良植物农艺性状的方法及其应用

1.本发明属于植物基因技术领域，具体涉及zmspl12基因及其编码蛋白用于改良植物耐盐、耐碱和/或耐低氮性状的方法及其应用。


背景技术：

2.土壤盐碱化是世界范围农作物产量和品质大幅下降的主要环境胁迫之一。据不完全统计,受盐分影响的土壤在全世界约为9.5438亿公顷,可造成达7-8%的生产力损失。此外，在农业种植生产中，过多施用氮肥容易导致环境污染，并且增加了农户的种植成本。
3.玉米是集粮食、饲料、工业原料于一身的重要农作物，也是世界上生产能力最高的农作物，其充足稳定的供应对保证世界范围内的粮食安全至关重要。因此，研究玉米耐盐碱、耐低氮的分子机制，挖掘耐盐碱、耐低氮的优异基因资源，培育耐盐碱、耐低氮的玉米新品种,对全球粮食安全和农业可持续发展有重要意义。


技术实现要素：

4.本文提到的所有参考文献都通过引用并入本文。除非有相反指明,本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。除非有相反指明,本文所使用的或提到的技术是本领域普通技术人员公知的标准技术。材料、方法和例子仅作阐述用,而非加以限制。
5.本技术实施例提供了一种改良植物农艺性状的功能基因spl12,所述基因在植物中过表达后，可以提高植物耐盐胁迫、碱胁迫和/或耐低氮的能力。
6.本技术实施例提供了一种改良植物农艺性状的方法，通过在植物中引入功能基因的过表达构建体，使植物获得耐盐、碱和/或耐低氮的表型，其特征在于，所述功能基因的核苷酸序列选自下列组的序列之一：(a）如基因位置号zm00001d015410所示的核苷酸序列；(b）如seqidno:1或2所示的核苷酸序列；(c）其编码氨基酸序列如seqidno:3所示的核苷酸序列；(d）在严谨杂交条件下能够与（a）-（c）中所述序列的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；(e）与（a）-(d)之任一所述核苷酸序列有80%（优选为至少85%）序列相似性，且在植物中过表达后具有使植物获得耐盐、耐碱和/或耐低氮表型的核苷酸序列；或(f）与（a）-（e）之任一所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
7.可选地，本技术中所述“严谨杂交条件”或“严谨条件”指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高（例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100%互补的靶序列。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特
异序列在规定离子强度ph下的热熔点（tm）约5-10℃。tm 为在平衡状态下50%与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度。严谨条件可为以下条件：其中在ph 7 .0到8 .3下盐浓度低于约1.0 m钠离子浓度，通常为约0.01到1.0 m钠离子浓度，并且温度对于短探针（包括但不限于10到50个核苷酸）而言为至少约30℃，而对于长探针（包括但不限于大于50个核苷酸）而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50%甲酰胺，5
×
ssc和1% sds，在42℃下培养；或5
×
ssc，1% sds，在65℃下培养，在0.2
×
ssc中洗涤和在65℃下于0.1% sds中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。
8.可选地，本技术实施例所提供的功能基因，还包括与本发明实施例所公开的耐盐、碱和/或耐低氮的功能基因的核苷酸序列有至少80％、85%、90%、95%、98％或99％序列相似性的同源基因，或者与本发明实施例所公开的功能基因的氨基酸序列有至少90%、95％或98％序列相似性的同源基因，且所述同源基因在植株中过表达后具有使植株获得耐盐、耐碱和/或耐低氮的表型，所述同源基因可以从任何植物中分离获得。
9.可选地，本技术实施例所述功能基因的同源基因核苷酸序列可以从任何植物中分离获得，包括但不限于芸苔属、玉米、小麦、高粱、两节荠属、白芥、蓖麻子、芝麻、棉籽、亚麻子、大豆、拟南芥属、菜豆属、花生、苜蓿、燕麦、油菜籽、大麦、燕麦、黑麦(rye)、粟、蜀黍、小黑麦、单粒小麦、斯佩尔特小麦(spelt)、双粒小麦、亚麻、格兰马草(gramma grass)、摩擦禾、假蜀黍、羊茅、多年生麦草、甘蔗、红莓苔子、番木瓜、香蕉、红花、油棕、香瓜、苹果、黄瓜、石斛、剑兰、菊花、百合科、棉花、桉、向日葵、芸苔、甜菜、咖啡、观赏植物和松类等。优选地，所述植物包括玉米、大豆、芥菜、粟、小麦、大麦、黑麦、稻、棉花和高粱。
10.本技术中所述的序列相似性的百分比可以通过公知的生物信息学算法来获得，包括myers和miller算法、needleman-wunsch全局比对法、smith-waterman局部比对法、pearson和lipman相似性搜索法、karlin和altschul的算法，这对于本领域技术人员来说是公知的。
11.本领域技术人员应该知晓，同一种植物不同品种间的同一基因存在单核苷酸多样性(single nucleotide polymorphism, snp)，即同一基因的核苷酸序列往往存在个别碱基的差异，但同一作物品种数量很多，发明人不可能进行一一列举，本技术实施例仅提供了玉米作物中具有代表性的品种的序列。因此，本领域技术人员应该知悉，不同品种来源的与本发明所保护基因及其核苷酸序列存在snp的核苷酸序列也在本发明的保护范围内。
12.可选地，本技术实施例提供的改良植物农艺性状的方法，其中所述的过表达构建体还包括与分离的功能基因核苷酸序列可操作连接且驱动功能基因超量表达的启动子。本技术中所述“超量表达”或“过表达”是指一种基因的表达产物在转基因植株中的表达量超过其在正常或非转基因植物中的表达量。
13.可选地，本技术中所述的启动子可以是组成型表达启动子、特异性表达启动子或是诱导型表达启动子。具体地，所述过表达启动子包括但不限于花椰菜花叶病毒camv35s启动子(odelletal，nature313：810-812(1985))、胭脂碱合酶(nos)启动子(ebertetal，pnas.84:5745-5749(1987))、adh启动子(walkeretal，pnas.84:6624-6628(1987))、蔗糖合酶启动子(yangetal，pnas.87:4144-4148(1990))、玉米泛素启动子ubiquitin
(cornejoetal，plantmolbiol.23:567-581(1993))、水稻actin1启动子等；所述特异性表达启动子包括但不限于根特异性表达启动子等，尤其在将本技术实施例所提供的功能基因应用于提高植物的耐低氮育种时，根作为氮吸收的主要器官，在根部特异表达对整体植株来说具有更好的效果；所述诱导型表达启动子包括但不限于非生物胁迫诱导型启动子、生物胁迫诱导型启动子等，在使用该类型启动子驱动本发明实施例所提供的功能基因时，当植株处于正常的生长环境时，无需启动抗逆基因表达，尽在出现逆境胁迫时，再启动，从而可以减少生物量的浪费。
14.可选地，本技术实施例所提供的改良植物农艺性状的方法，可以用于任何植物的耐盐、耐碱和/或耐低氮性状的改良，所述植物包括单子叶植物和/或双子叶植物，可选地，包括但不限于芸苔属、玉米、小麦、高粱、两节荠属、白芥、蓖麻子、芝麻、棉籽、亚麻子、大豆、拟南芥属、菜豆属、花生、苜蓿、燕麦、油菜籽、大麦、燕麦、黑麦(rye)、粟、蜀黍、小黑麦、单粒小麦、斯佩尔特小麦(spelt)、双粒小麦、亚麻、格兰马草(grammagrass)、摩擦禾、假蜀黍、羊茅、多年生麦草、甘蔗、红莓苔子、番木瓜、香蕉、红花、油棕、香瓜、苹果、黄瓜、石斛、剑兰、菊花、百合科、棉花、桉、向日葵、芸苔、甜菜、咖啡、观赏植物和松类等。优选地，所述植物包括玉米、大豆、芥菜、粟、小麦、大麦、黑麦、稻、棉花和高粱。
15.可选地，本技术实施例还提供了上述任一所述的改良植物农艺性状的方法在植物育种中的应用。所述植物包括上述任一所述的植物。
16.可选地，本技术提供了一种非作为繁殖材料的植物细胞、组织、器官或商业产品，所述植物细胞、组织、器官或商业产品由权利要求1-6之任一所述的方法获得。所述商业产品包括但不限于完整或加工的种子、动物饲料、油、粗粉、细粉、薄片、麸皮、生物质或燃料产品等。
17.可选地，本技术实施例还提供了一种表达盒、重组载体或转化菌株在改良植物农艺性状中的应用，所述表达盒、重组载体或转化菌株含有可使植物获得耐盐、耐碱和/或耐低氮表型的分离的功能基因核苷酸序列，其特征在于，所述分离的功能基因的核苷酸序列选自下列组的序列之一：(a）如基因位置号zm00001d015410所示的核苷酸序列；(b）如seqidno:1或2所示的核苷酸序列；(c）其编码氨基酸序列如seqidno:3所示的核苷酸序列；(d）在严谨条件下能够与（a）-（c）中所述序列的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；(e）与（a）-(d)之任一所述核苷酸序列有80%（优选为至少85%）序列相似性，且在植株中过表达后具有使植株获得耐盐、耐碱和/或耐低氮表型的核苷酸序列；或(f）与（a）-（e）之任一所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
18.可选地，所述表达盒、重组载体或转化菌株还包括与功能基因核苷酸序列可操作连接且驱动功能基因超量表达的启动子。所述启动子包括但不限于前述所述的组成型表达启动子、特异性表达启动子或诱导型表达启动子。
19.为免歧义，本技术中所述的将核苷酸序列、载体、构建体或表达盒转入植株或引入植株或对植株进行转化，均指通过常规的转基因方法或与目标转基因植株进行杂交的方法，将目标核苷酸序列、构建体、载体或表达盒转入到受体细胞或受体植株中。本领域技术人员知悉的任何转基因方法均可被用于将重组表达载体转化进植物细胞中，以产生本技术
g）敲除株系及过表达转基因株系低氮条件下相关指标测定。
30.图9为野生型玉米和zmspl12过表达转基因株系在低氮条件下不同形式氮含量；图中，（a-c）为zmspl12过表达转基因株系低氮条件下地上部分硝酸盐（no
3-）、亚硝酸盐（no
2-）、铵盐（nh
4+
）含量；（d-f）为zmspl12过表达转基因株系低氮条件下地下部分硝酸盐（no
3-）、亚硝酸盐（no
2-）、铵盐（nh
4+
）含量。
具体实施方式
31.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
32.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；除特殊说明外，定量试验均设5个以上的重复实验。
33.实施例1.zmspl12参与植物对盐、碱胁迫的应答本技术中所述zmspl12基因在玉米基因组上的位置为zm00001d015410，其基因组核苷酸序列如seq id no:1所示，编码区（cds）核苷酸序列如seq id no:2所示，编码的蛋白氨基酸序列如seq id no:3所示。
34.为了验证zmspl12的表达是否参与植物对盐、碱胁迫的应答，在c01玉米材料长至两叶一心期时将其放置于含150mm nacl水溶液及120mm nahco3水溶液中，并分别设置一组放于水中作为其对照，分别取盐、碱处理后0 h、1h、3h、6h、12h、24h、48h和72h长势一致的幼嫩叶片和根及其相应对照，进行zmspl12基因的荧光定量pcr实验，具体的引物是：zmspl12-qpcr-f 5'-gatggagcagcggatcttca-3'(seq id no:4)，zmspl12-qpcr-r5'-agttcctgccatgcgttaca-3'(seq id no:5)。结果显示盐胁迫下，zmspl12在叶中的表达量下调，但在根中表达量显著上调，24h 达到最高值（图1a，b）；碱胁迫下，zmspl12在叶中的表达量下调，但在根中表达量显著上调，48h 达到最高值（图1c，d）。结果表明，zmspl12在玉米幼苗根中的表达受到盐、碱信号的诱导，推测zmspl12可能参与植物对盐、碱胁迫的应答。
35.实施例2.zmspl12参与植物对硝酸盐信号的应答为了验证zmspl12的表达是否参与植物对硝酸盐信号的应答，在b73玉米材料长至两叶一心期时将其放置于含0.8mm kno3营养液、3.2mm kno3及14.4 mm kno3营养液中，并分别设置一组放于不含kno3的营养液中作为其对照。营养液组成为（mmol/l）:k2so
4 0.75，kh2po
4 0.25，mgso4·
7h2o0.65，deta-nafe0.1，h3bo
3 0.01，mnso4·
h2o0.001，znso4·
7h2o0.001，cuso4·
5h2o0.0001，（nh4）6mo7o
24
·
4h2o0.5x10-6
，cacl
2 0.2。分别取处理后0 h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h和72h长势一致的幼嫩叶片和根及其相应对照，进行zmspl12基因的荧光定量pcr实验，结果显示0.8mm kno3处理下，zmspl12在叶中的表达量显著上调，并在2h达到最高值，但在根中没有显著变化（图2a，b）；3.2mm kno3处理下，zmspl12在叶中的表达量显著上调，并在0.5h达到最高值，但在根中没有显著变化（图2c，d）；14.4mm kno3处理下，zmspl12在叶中的表达量显著上调，并在1h达到最高值，但在根中波动上升，在24h达到最高值（图2e，f）。结果表明，zmspl12在玉米幼苗根中的表达受到硝酸盐信号的诱导，推测zmspl12可能参与植物对硝酸盐信号的应答。
36.实施例3.zmspl12纯合突变体及过表达材料的获得为了研究zmspl12基因的功能，发明人构建了zmspl12的crispr/cas9基因敲除载体，并进行了玉米植株的遗传转化，共获得10个有效独立转化事件。其中crispr/cas9基因编辑载体结构如图3（a）所示。通过pcr鉴定及核苷酸序列的桑格测序最终获得了zmspl12（ko#1，ko#2）纯合突变体，所述基因编辑的靶标序列及突变位点分别如图3（b）所示。其中zmspl12-ko#1的突变类型是第一个靶位点处4 bp缺失造成的移码突变；zmspl12-ko#2的突变类型是第一个靶位点处5 bp缺失造成的移码突变。此外两个突变体在第二个靶位点处都包括一个单碱基的插入。
37.同时，发明人还构建了zmspl12过表达载体pcpb-ubi::zmspl12m-egfp，载体结构如图3（c）所示，并进行玉米植株的农杆菌转化，经过转基因筛选，获得了纯合的zmspl12-oe过表达材料(c01背景) ，将经鉴定表达量升高的两个过表达株系编号分别为#499、#500。
38.实施例4.zmspl12过表达材料盐胁迫表型为了验证zmspl12是否参与了盐胁迫响应，发明人将经鉴定表达量升高的zmspl12-oe材料及其相应对照材料进行盐胁迫处理。结果表明，处理13天后， zmspl12过表达材料#499、#500生长正常，#499-ck、#500-ck第一片叶枯萎；处理30天后，过表达材料#499、#500的存活率显著高于#499-ck、#500-ck；对照组的过表达材料#499、#500鲜重显著低于#499-ck、#500-ck，而处理组的过表达材料鲜重与其对照材料无显著性差异；过表达材料#499、#500的叶长/叶宽/株高胁迫比显著低于#499-ck、#500-ck（图4）。这些结果说明zmspl12基因过表达后提高玉米的耐盐性能。
39.实施例5.zmspl12不同材料碱胁迫表型为了验证zmspl12是否参与了碱胁迫响应，发明人将经鉴定表达量升高的 zmspl12-oe材料及其相应对照材料进行碱胁迫处理。结果表明，处理13天后， zmspl12过表达材料#499、#500生长正常，#499-ck、#500-ck第一片叶枯萎；处理30天后，过表达材料#499、#500的存活率显著高于#499-ck、#500-ck；对照组的过表达材料#499、#500鲜重显著低于#499-ck、#500-ck，而处理组的过表达材料鲜重与其对照材料无显著性差异；过表达材料#499、#500的叶宽/株高胁迫比显著低于#499-ck、#500-ck，而叶长的胁迫比则相反（图5）。这些结果说明zmspl12基因过表达后提高玉米的耐碱性能；与盐胁迫相比，碱胁迫对植物叶宽的影响更大，对株高、叶长的影响变小，表明植物对盐、碱胁迫的响应可能存在不同的分子机制。
40.实施例6.zmspl12不同材料钠、钾离子含量测定进一步，本发明对这些材料在正常和盐处理条件下的钠、钾离子含量进行了测定，结果表明：盐胁迫下，zmspl12敲除植株地上部组织表现出较高的na
+
含量、较低的k
+
含量和较高的na
+
/k
+ 比；地下部组织钠、钾离子含量与其对照相比无显著性差异（图6）。这结果说明zmspl12通过促进离子 (na
+
和k
+
) 稳态来提高植物耐盐性。
41.实施例7.zmspl12不同材料盐胁迫下ros水平检测发明人利用 dab 和 nbt 染色来定性检测对照和盐胁迫下植物体内h2o2和o2•−
的水平。如图7所示，在对照条件下，zmspl12不同材料中积累的 h2o2和 o2•−
水平大致相当，而在盐胁迫条件下，zmspl12-oe材料中积累的h2o2和 o2•−
显著低于其对照材料。这些结果说明zmspl12参与了盐胁迫下体内ros的水平调节，zmspl12的超量表达可以显著降低植株体内
的ros含量。
42.实施例8.zmspl12敲除及过表达材料低氮处理表型为了验证zmspl12是否提高了对低氮环境的耐受性，发明人将zmspl12敲除材料和经鉴定表达量升高的 zmspl12-oe材料进行低氮处理（低氮处理为0.05mm kno3，以2mm kno3为正常对照）。植物缺氮的典型特征是叶片含氮量和叶绿素含量下降。结果表明，处理24天后，低氮处理下的zmspl12敲除植株zmspl12-ko#1第一片叶枯萎，第二片叶变黄，而野生型对照ck1仅第一片叶枯萎；zmspl12过表达材料表型刚好相反，#500生长正常，而野生型对照#500-ck第一片叶枯萎，第二片叶叶变黄；低氮处理下，zmspl12-ko#1的第四片叶含氮量显著低于野生型对照ck1，但#500第四片叶含氮量与野生型对照#500-ck没有显著差异；正常条件和低氮条件下，zmspl12-ko#1的第四片叶叶绿素含量都低于野生型对照ck1，而#500第四片叶叶绿素含量在正常条件下与野生型对照#500-ck没有显著差异，但在低氮条件下显著大于野生型；正常条件和低氮条件下，zmspl12-ko#1的第四片叶最大光合效率都低于野生型对照ck1，尤其是低氮条件下达到了显著性差异，而#500刚好相反，其第四片叶最大光合效率在正常和低氮处理条件下都显著大于野生型对照#500-ck（图8）。
43.这些结果说明zmspl12基因敲除后降低了玉米对低氮条件的耐受性，相反，zmspl12基因过表达后提高玉米对低氮条件的耐受性，进一步说明zmspl12基因增强了植物对氮的利用率。
44.实施例9.zmspl12过表达材料低氮处理下不同形式氮含量检测进一步，本发明对zmspl12过表达材料#500及其野生型对照#500-ck在正常和低氮处理条件下的硝酸盐（no
3-）、亚硝酸盐（no
2-）、铵盐（nh
4+
）含量分别进行了测定，结果表明：在地上部分叶片中，正常处理条件下，#500硝酸盐和亚硝酸盐含量与野生型对照#500-ck没有显著性差异，其铵盐含量显著低于野生型对照#500-ck。而低氮处理条件下，#500的硝酸盐和铵盐的含量都显著低于野生型对照#500-ck，其亚硝酸盐的含量与野生型对照#500-ck没有显著差异；在地下部分根中，正常处理条件下，#500亚硝酸盐和铵盐含量与野生型对照#500-ck都没有显著性差异，但其硝酸盐含量显著高于野生型对照#500-ck。低氮处理条件下，#500亚硝酸盐含量与野生型对照#500-ck都没有显著性差异，但其但其硝酸盐和铵盐含量显著高于野生型对照#500-ck。这些结果说明zmspl12通过提高根部硝酸盐和铵盐含量来提高植物的氮利用效率，从而提高对低氮环境的耐受性。
45.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。