益生菌、组合物及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物领域，具体涉及一株卷曲乳杆菌、一株类干酪乳酪杆菌、一株发酵粘液乳杆菌、益生菌组合物及其应用。


背景技术：

2.现在人们的工作生活压力越来越大，生活作息也极其不规律，生物钟被打乱，身体抵抗力下降，私处免疫力不断降低，有害菌乘虚而入，引发各种妇科炎症，即便平时注意个人卫生，但抵抗力差还是会诱发炎症。再加上现代人们工作一般都是久坐不动，长时间不动会引起会阴部透气不良，血液循环受阻，因而也比较容易发生感染，引发妇科炎症。
3.据报道，妇科炎症已经成为危害女人健康的一大罪魁祸首。妇科炎症给生活带来许多不适，轻者有白带异常、外阴瘙痒、异味严重等症状，让人难以启齿，备受煎熬；重者影响夫妻生活，引起不孕，甚至会诱发癌变。而且妇科炎症容易反复发作，会严重破坏免疫系统。
4.乳酸杆菌是健康女性生殖道中最主要的微生物，具有维持生殖道生态平衡和防止病原体入侵的功能。近年来，国内外有越来越多相关研究表明益生菌可用于女性生殖感染的预防与治疗，益生菌制剂治疗阴道感染包括口服或经阴道应用益生菌制剂途径，口服益生菌有效的理论是认为直肠可将益生菌分泌至阴道。 anukam等采用鼠李糖乳杆菌gr-1和罗伊氏乳杆菌rc-14菌株制备的益生菌食品对细菌性阴道病bv患者进行为期30d的随机对照研究，治疗结束后，服用益生菌食品组中88％个体的nugent评分恢复正常，并且bv测试阴性，而对照组只有40％个体的nugent评分恢复正常，差异具有统计学意义。davar等研究复发性外阴阴道念珠菌病患者应用氟康唑150mg联合口服益生菌治疗的有效性，发现氟康唑联合益生菌组6个月vvc的复发率为7.2％，安慰剂组复发率为35.5％。
5.目前虽然国内市场不乏针对女性生殖健康的益生菌食品，但根据lumina的数据显示，大部分女性益生菌食品主要采用了鼠李糖乳杆菌gr-1和罗伊氏乳杆菌rc-14菌株(由丹麦科汉森公司提供)，其并非国内人群的生殖道优势菌。此外，用于改善女性生殖健康的食品益生菌株大多是分离自肠道，耐酸性能力弱，且难以成功定植于阴道，因而对女性生殖感染的预防或治疗效果不理想。


技术实现要素：

6.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供了分离自健康女性阴道的益生菌，所述的益生菌为植物乳植物杆菌 (lactiplantibacillus plantarum)、卷曲乳杆菌(lactobacillus crispatus)、类干酪乳酪杆菌(lacticaseibacillus paracasei)和发酵粘液乳杆菌(limosilactobacillus fermentum)，并进一步提供了由上述菌株进一步制得的乳杆菌组合物、益生菌产品。所述益生菌产品可以改善女性生殖健康。
7.在本发明第一方面提出了一株菌株，所述菌株为卷曲乳杆菌，命名为 lsa-139菌
株，保藏于广东省微生物菌种保藏中心（地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼），保藏编号为gdmccno.62747，保藏日期为2022年08月29日，分类命名：lactobacillus crispatus。所述lsa-139菌株产酸能力优异，一定程度的产过氧化氢能力，对阴道加德纳菌有优异的抑菌效果，并对人子宫颈癌上皮细胞(hela细胞)和人膀胱移行细胞癌细胞(t24细胞)具有较高粘附能力。
8.在本发明的一些实施方式中，所述lsa-139菌株具有序列如seq id no:1 所示的16s rdna基因片段和序列如seq id no:2所示的phes基因片段。
9.在本发明第二方面提出了一株菌株，所述菌株为类干酪乳酪杆菌，命名为 lsa-1643菌株，保藏于广东省微生物菌种保藏中心（地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼），保藏编号为gdmccno.62748，保藏日期为2022年08月29日，分类命名：lacticaseibacillusparacasei。所述lsa-1643菌株产酸能力较佳，一定程度的产过氧化氢能力，对阴道加德纳菌有较佳的抑菌效果。
10.在本发明的一些实施方式中，所述lsa-1643菌株具有序列如seq id no:3 所示的16s rdna基因片段和序列如seq id no:4所示的phes基因片段。
11.在本发明第三方面提出了一株菌株，所述菌株为发酵粘液乳杆菌，命名为 lsa-1663菌株，保藏于广东省微生物菌种保藏中心（地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼），保藏编号为gdmccno.62749，保藏日期为2022年08月29日，分类命名：limosilactobacillusfermentum。所述lsa-1663菌株具有一定的产酸能力，产过氧化氢能力优异，对阴道加德纳菌有一定的抑菌效果，并对人子宫颈癌上皮细胞(hela细胞)和人膀胱移行细胞癌细胞(t24细胞)具有较好的粘附能力。
12.在本发明的一些实施方式中，所述lsa-1663菌株具有序列如seq id no:5 所示的16s rdna基因片段和序列如seq id no:6所示的phes基因片段。
13.在本发明第四方面提出一种乳杆菌组合物，包括所述lsa-139菌株、所述 lsa-1643、所述lsa-1643菌株以及lsa-410菌株。所述lsa-410菌株为保存于广东微生物菌种保藏中心，保存编号为gdmcc no.62712的植物乳植物杆菌。所述乳杆菌组合物中的所有菌株均具有优异的益生特性，具有产酸和产过氧化氢能力，能够耐受胃液和肠液，对子宫颈癌上皮细胞hela及人膀胱移行细胞癌细胞t24细胞具有粘附作用，能有效抑制泌尿生殖道致病菌的生长和定植，改善女性阴道微生态环境。
14.在本发明的一些实施方式中，所述益生菌组合物的总活菌数不低于5.0
×
109cfu/g，每种单菌含量不低于1.0
×
108cfu/g。
15.在本发明的第五方面提出了所述乳杆菌组合物在制备调节阴道菌落生态的药物、抑菌产品或清洗护理产品中的应用。所述药物的剂型可以为粉剂、栓剂、凝胶、口服液、硬胶囊、软胶囊等。所述抑菌产品、清洗护理产品的剂型可以是洗液、凝胶、栓剂等。
16.在本发明的一些实施方式中，所述抑菌产品抑制的致病菌包括尿路致病性大肠杆菌、阴道加德纳菌、白假丝酵母、光滑假丝酵母、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、克里斯滕塞尼气球菌中的任意一种或多种。
17.在本发明的第六方面提出了所述乳杆菌组合物在制备调节阴道微生态的保健品、膳食补充剂或食品中的应用。所述保健品、膳食补充剂、食品的剂型可以是饮料、固体饮料、软饮料、硬胶囊、软胶囊、多层硬胶囊、溶豆、冻干粉、奶豆、巧克力、夹心软糖、夹心巧克力、
茶饮料、冷萃咖啡等。
18.在本发明的第七方面提出了一种益生菌产品。所述益生菌产品至少包括以下(1)至(6)中的一种：
19.(1)所述乳杆菌组合物；
20.(2)含有所述乳杆菌组合物的菌粉；
21.(3)含有所述乳杆菌组合物的活菌液；
22.(4)含有所述乳杆菌组合物的死菌液；
23.(5)由所述乳杆菌组合物经代谢途径获得的代谢产物；
24.(6)从所述乳杆菌组合物提取获得的提取物。
25.在本发明的一些实施方式中，所述益生菌产品为固态食品或液态食品，所述固态食品包括胶囊、冻干粉、吞服片剂、颗粒剂或含片，所述液态食品包括口服液或饮料。区别于传统认为的经口摄入鼠李糖乳杆菌gr-1和罗伊氏乳杆菌rc-14菌株只能暂时定植而无法长期存活的观点，所述益生菌产品具有长久的定植效果。使用者在连续服用一段时间(15-30d)后，即使停用所述益生菌产品，其阴道分泌物样本仍然能够维持较高的乳杆菌活菌数量。
26.在本发明的一些实施方式中，还包含植物提取物和/或生理可接受的辅料。所述植物提取物选自蔓越莓果粉、玫瑰茄粉、蒲公英粉中的一种或多种。
附图说明
27.图1为本发明实施例1中各乳杆菌菌落形态图，a为lsa-139菌株、b为lsa-1643菌株、c为lsa-1663菌株；
28.图2为本发明实施例1中各乳杆菌经革兰氏染色后的形态图，a为lsa-139菌株、b为lsa-1643菌株、c为lsa-1663菌株；
29.图3为本发明实施例2中的所述乳杆菌组合物及对照组合物(罗伊式乳杆菌rc-14+鼠李糖乳杆菌gr-1)体外抑菌能力的检测结果图，图a的抑菌对象为尿路致病性大肠杆菌atcc700928，图b的抑菌对象为白假丝酵母菌cgmcc2.4159，图c的抑菌对象为金黄色葡萄球菌cmcc(b)26003；
30.图4为本发明实施例2中的耐受不同ph模拟胃液、模拟肠液的结果图；
31.图5为本发明实施例3中溶血性的测定结果照片，图a为lsa-139菌株、图b为lsa-1643菌株、图c为lsa-1663菌株；
32.图6为本发明实施例4中志愿者阴道分泌物的乳杆菌数量检测柱状图。
具体实施方式
33.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
34.以下实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得
的常规产品；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
35.以下实施例中所用到的细菌培养基成分及配制方法如下：
36.mrs肉汤/琼脂的配制：称取mrs肉汤成品粉末24.05g，溶解至500ml 去离子水中，并将ph调节至6.2
±
0.2，标记培养基名称和配制日期，置于高压灭菌锅中121℃灭菌15min，冷却后置于4℃冰箱备用；琼脂平板即在肉汤培养基中加入1.5％的琼脂制备而成。
37.兔血bhi肉汤/琼脂的配制：称取bhi肉汤成品粉末19.25g和麦芽糖5.0g，溶解于500ml去离子水中，将ph调节至7.4
±
0.2，标记培养基名称和配制日期，置于高压灭菌锅中121℃灭菌15min，待培养基冷却至50至60℃后加入无菌脱纤维兔血和维生素混合液，冷却后置于4℃冰箱备用；琼脂平板即在肉汤培养基中加入1.5％的琼脂制备而成。
38.模拟胃液/肠液：参照中国药典进行制备ph 2.0和ph 3.0的模拟胃液(sgf) 以及ph 6.8的模拟肠液(sif)，0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
39.各实施例中所用到的各类菌株的分离获取方法如下：
40.1.罗伊氏乳杆菌rc-14和鼠李糖乳杆菌gr-1的分离、纯化和增菌培养
41.购入道格拉斯制药有限公司的“科立纯女性益生菌胶囊”。在洁净工作区中将胶囊溶解于10ml的生理盐水中，梯度稀释涂布于mrs平板上，37℃厌氧培养至mrs琼脂上长出明显的菌落，挑取不同形态单菌落接种至mrs肉汤，37℃厌氧培养24h。分别取菌液进行菌种鉴定，鉴定得到的罗伊氏乳杆菌rc-14的 16s rdna序列如seq id no:7所示，鼠李糖乳杆菌gr-1的16s rdna序列如seqid no:8所示，保藏菌液，于-80℃冰箱冻存。
42.2.罗伊氏乳杆菌rc-14和鼠李糖乳杆菌gr-1组合物获取
43.将活化的罗伊氏乳杆菌rc-14与鼠李糖乳杆菌gr-1离心，弃上清，pbs溶液重悬调至适宜浊度(～108cfu/ml)，等比例接种至mrs液体培养基中(总接种量6％v/v)，37℃厌氧培养24h后即得。
44.2.病原菌株的获取
45.尿路致病性大肠杆菌atcc 700928(购自宁波明舟生物科技有限公司)；阴道加德纳菌atcc 14018(购自广东微生物保藏中心)；白假丝酵母菌cgmcc2.4159(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)；金黄色葡萄球菌 cmcc(b)26003(购自广东环凯微生物有限公司)。
46.3.lsa-410菌株的获取
47.所述lsa-410菌株是植物乳植物杆菌(lactiplantibacillus plantarum)，保藏于广东微生物菌种保藏中心，菌株编号为gdmcc no.62712的菌株。
48.实施例1菌株的分离和鉴定
49.1.乳杆菌菌群的分离
50.用阴道拭子采集通过健康体检的育龄期女性阴道分泌物样本，将阴道拭子置于eswab运输保存液(copan公司)中，震荡混匀，取样加入无菌pbs溶液进行连续十倍梯度稀释，取不同浓度稀释液分别涂布于mrs琼脂上，置于37℃培养箱中厌氧培养48h。由于乳杆菌具有调节人体免疫功能、抑制致病菌感染等作用，其安全性被高度认可，所以挑取生长菌落形态呈白色圆边、表面有光泽等乳杆菌典型特征的菌株，分别于mrs平板上进行划线培养分离。其中三株分离得到的乳杆菌由于在初筛过程中在产乳酸能力、产过氧化氢能力、对泌尿生殖道致病菌抑制效等方面具有突出表现，因此保留进一步检测各菌株特性。这三株乳杆
菌分别被命名为lsa-139菌株、lsa-164菌株和lsa-1663菌株，保藏菌液，于-80℃冰箱冻存。
51.2.菌株的鉴定
52.益生菌组合物中各单菌16s rdna基因序列鉴定和phes基因序列鉴定
53.通过细菌基因组dna快速抽提试剂盒提取乳杆菌的dna，并以其作为模板进行扩增，得到pcr产物。扩增16s rdna基因序列的引物为27f： 5'-agagtttgatcctggctcag-3'(seq id no:9)和1492r：5'-tacggttaccttgttacgactt-3'(seq id no:10)；扩增phes基因序列的引物为phes-21-f：5
’‑
cayccngchcgygayatgc-3’(seq id no:11)和 phes-23-r:5
’‑
ggrtgraccatvccngchcc-3’(seq id no:12)。
54.16s rdna基因序列鉴定pcr条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s， 55℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃延伸10min。
55.phes基因序列鉴定pcr条件为：95℃预变性5min，95℃变性1min，46℃退火135s，72℃延伸75s，共3个循环；95℃变性35s，46℃退火75s，72℃延伸75s，共30个循环；72℃延伸7min。
56.上述扩增16s rdna基因和phes基因的pcr均可采用相同的扩增体系：12.5 μl taq pcr master mix缓冲液，浓度为10μmol的上游和下游引物各1μl，1-2μldna模板，余下用无核酸酶的水补充至25μl。
57.使用1％凝胶电泳对所得到的pcr产物进行检测，阳性结果则将产物送至测序公司进行sanger测序。随后于ncbi数据库上对得到的细菌序列进行blast 序列分析。
58.经过上述鉴定结果，确定lsa-139菌株分类命名为卷曲乳杆菌(lactobacilluscrispatus)。确定lsa-1643菌株分类命名为类干酪乳酪杆菌(lacticaseibacillus paracasei，曾用名为副干酪乳杆菌，lactobacillus paracasei)，确定lsa-1663菌株分类命名为发酵粘液乳杆菌(limosilactobacillus fermentum，曾用名为发酵乳杆菌，lactobacillus fermentum)。
59.3.菌株形态特征
60.将活化各乳杆菌划线至mrs平板上，37℃厌氧培养48h后观察菌落形态。同时挑取平板上的单菌落进行革兰氏染色，用显微镜观察菌株特征。所述 lsa-139菌株形态如图1a所示：mrs琼脂培养基上的菌落呈白色，近圆形，表面湿润，不透明，边缘不整齐。所述lsa-1643菌株形态如图1b所示：mrs琼脂培养基上的菌落呈白色，圆形，表面湿润，不透明，边缘整齐。所述lsa-1663 菌株形态如图1c所示：mrs琼脂培养基上的菌落呈白色，圆形，表面湿润，不透明，边缘整齐。
61.革兰氏染色镜检结果如图2所示。图2a为lsa-139菌株镜检结果：革兰氏染色阳性，菌体呈杆状，0.4-0.8μm
×
1.1-3.8μm，单个或成对排列。图2b为 lsa-1643菌株的镜检结果：革兰氏染色阳性，菌体呈杆状，0.4-0.6μm
×
1.0-2.4 μm，单个或成对排列。图2c为lsa-1663菌株的镜检结果：革兰氏染色阳性，菌体呈杆状，0.6-0.8μm
×
0.8-1.7μm，单个或成对排列。
62.4.生理生化指标检测
63.分别取lsa-139菌株、lsa-1643菌株及lsa-1663菌株进行传代孵育，离心后弃上清将菌体分别重悬于生理盐水中制备为3麦氏标准菌悬液，采用梅里埃厌氧菌及棒状杆菌鉴定卡片(vitek anc)，对各菌株分别进行碳水化合物测定，结果如表1所示。
64.表1各菌株生理生化特征
[0065][0066][0067]
符号说明:“+”，阳性；“w”，弱阳性；
“‑”
，阴性。
[0068]
实施例2乳杆菌组合物益生特性检测
[0069]
平行对照的方式检测以下单菌或组合物的益生特性：lsa-410菌株、lsa-139 菌株、lsa-1643菌株、lsa-1663菌株、乳杆菌组合物、罗伊氏乳杆菌rc-14、鼠李糖乳杆菌gr-1、
对照组合物。所述乳杆菌组合物由活化的lsa-410菌株、 lsa-139菌株、lsa-1643菌株、lsa-1663菌株等比混合而成，所述对照组合物由罗伊氏乳杆菌rc-14和鼠李糖乳杆菌gr-1等比混合而成。
[0070]
1、d型乳酸和l型乳酸的产量测定
[0071]
将各乳杆菌及组合物于37℃厌氧培养24h后，离心，取上清液用于乳酸含量的测定。使用高效液相法检测发酵液中d-乳酸、l-乳酸的含量，具体的色谱条件如表2所示，测定结果见表4。
[0072]
表2高效液相法检测乳杆菌发酵液乳酸含量测定的色谱条件
[0073][0074][0075]
2、产过氧化氢能力检测
[0076]
将各乳杆菌及组合物于37℃厌氧培养16h，取出菌株，置于摇床震荡培养 3h(200rpm)，将培养完成的菌悬液以4500rpm离心10min，乳杆菌组合物收取上清过0.22μm滤膜处理后用于过氧化氢含量的测定。使用高效液相法检测发酵液中的过氧化氢含量。检测方法具体的色谱条件如表3所示，发酵液中过氧化氢含量的测定结果如表4所示。
[0077]
表3高效液相法检测过氧化氢含量测定的色谱条件
[0078][0079]
3、对宫颈癌细胞hela和人膀胱移行细胞癌细胞t24细胞的粘附作用分析
[0080]
3.1.菌株对宫颈癌细胞hela的粘附作用分析
[0081]
hela细胞源自妇女的子宫颈癌细胞，增殖迅速，常用作阴道上皮细胞的替代细胞用于体外研究。益生菌对上皮细胞的黏附力越强越有利于定殖于人体，与病原菌竞争占位，防止病原菌的入侵，而且更有利于其发挥益生功能。
[0082]
将t75细胞培养瓶中培养hela细胞(购自中国科学院细胞库)以1
×
106cells/ml的密度接种2ml于6孔板中，待培养48h后形成单细胞层。分别将各乳杆菌或组合物的培养液离心去除上清后，重悬菌体于pbs溶液中，调整菌液浊度为1.0mcf，离心去上清，用等体积dmem高糖培养基(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)重悬菌体，取菌悬液稀释涂板于mrs琼脂，厌氧培养 48h后，统计每个平板的克隆数。粘附前，吸出细胞培养板中的培养液，每孔加入2ml的pbs溶液洗涤细胞3次后加入2ml菌悬液，使菌体充分散均匀，将细胞培养板和剩余菌悬液置于37℃，5％co2培养箱中黏附2h，每组3个平行。粘附后，将细胞培养板中培养液吸出，每孔加入2ml的pbs溶液洗涤细胞3次后加入0.5ml 0.25％胰蛋白酶-edta溶液消化
2.5min，吸出消化液，随后加入 1ml的pbs溶液轻轻吹打细胞使其脱离和加入1ml 0.05％tritonx-100裂解细胞，制成菌悬液，梯度稀释，涂布于mrs琼脂上，厌氧培养48h后，统计每个平板的菌落数。
[0083]
3.2.菌株对人膀胱移行细胞癌细胞t24细胞的粘附作用分析
[0084]
t24细胞源自女性膀胱移行细胞癌患者，增殖迅速，常用作膀胱上皮细胞的替代细胞用于体外研究。
[0085]
在t75细胞培养瓶中培养人膀胱移行细胞癌细胞t24细胞(购自北纳生物) 以1
×
106cells/ml的密度接种2ml于6孔板中，待培养48h后形成单细胞层。分别将各乳杆菌或组合物的培养液离心去除上清后，重悬沉淀的菌体于pbs溶液中，调整菌液浊度为1.0mcf，离心去除上清，用等体积mccoy’s 5a培养基 (购自北纳生物)重悬菌体，取菌悬液稀释涂板于mrs琼脂，厌氧培养48h后，统计每个平板的初始细菌数量。粘附前，吸出细胞培养板中的培养液，每孔加入 2ml的pbs溶液洗涤细胞3次后加入2ml菌悬液，使菌体充分分散均匀，将细胞培养板和剩余菌悬液置于37℃，5％co2培养箱中黏附2h。粘附结束后，将细胞培养板中培养液吸出，每孔加入2ml的pbs溶液洗涤细胞3次。每孔加入0.5ml 0.25％胰蛋白酶-edta溶液消化2.5min，吸出消化液，加入1ml pbs 溶液吹打细胞使其脱离，加入1ml 0.05％tritonx-100裂解细胞，制成菌悬液，梯度稀释，取100μl菌液涂布于mrs琼脂上，厌氧培养48h后，统计每个平板的菌株粘附处理后活菌数。
[0086]
粘附率的计算公式如下：黏附率＝菌株存活率(％)＝n
l
/n0×
100％；
[0087]
式中，n
1-菌株粘附处理后活菌数(cfu/ml)；n
0-菌株粘附前活菌数 (cfu/ml)。
[0088]
4.乳杆菌组合物对阴道加德纳菌的体外抑菌性能检测
[0089]
将各乳杆菌或组合物分别与阴道加德纳菌共培养，进行抑菌效果分析。
[0090]
菌饼的制备方法为：
①
菌株活化后离心，弃上清，重悬菌体并将菌液浊度调节至适宜浊度(～108cfu/ml)；
②
取0.5ml悬液与20ml冷却至50至60℃的mrs琼脂培养基再次混合，冷却凝固后37℃厌氧培养24h，随后打孔制备菌饼。可采用相同方法制备所述乳杆菌组合物和所述对照组合物的菌饼，只需在步骤
①
中分别重悬多种所需单菌的悬液，并等比例混合即可。
[0091]
将活化的阴道加德纳菌离心，弃上清，重悬菌体，调节至适宜浊度(～108cfu/ml)，取100μl菌悬液接种于兔血bhi平板涂布均匀，将制备好的菌饼置于涂有病原菌的琼脂平板上，37℃厌氧培养48h，测量抑菌圈直径。
[0092]
经上述1至4项的对比试验，对比结果如表4所示：
[0093]
表4单菌及组合物益生性能比较
[0094][0095]
注：“nd”表示不产该产物
[0096]
对比结果显示：从表4可以看出，lsa-410等4株乳杆菌的益生特性表现比较优异，而由4种乳杆菌组合而成的乳杆菌组合物在产酸能力、产过氧化氢能力及对阴道加德纳菌株(bv主要致病菌)的抑制能力均优于各单菌，且各益生性能明显由于对照组合物。
[0097]
5.对尿路致病性大肠杆菌、白假丝酵母菌和金黄色葡萄球菌的抑菌性检测
[0098]
将各乳杆菌或组合物于37℃厌氧培养24h后，4500rpm离心10min，收集上清过0.22μm滤膜处理后备用。将活化二代的尿路致病性大肠杆菌、白假丝酵母菌和金黄色葡萄球菌离心，弃上清，适宜培养基重悬菌体，调节至适宜浊度 (～108cfu/ml)，取100μl添加至96孔板，分别加入获取的各乳杆菌组上清液100μl，每组3个平行。作为空白对照组，测定了100μl病原菌菌液混合100 μl空白mrs肉汤培养基的生长情况。分别测定共培0h、12h、24h、48h后od 值(600nm)，通过比较各组病原菌生长情况了解单菌或组合物的抑菌性，结果见图3。
[0099]
如图3所示，无论是单菌还是组合物对于尿路致病性大肠杆菌及金黄色葡萄球菌均具有明显的抑菌效果，但是对于白假丝酵母菌(外阴阴道假丝酵母病的主要致病菌)各试验组却呈现出了较大差距。从图3b可以看出，lsa-139菌株、 lsa-1643菌株、罗伊氏乳杆菌rc-14、鼠李糖乳杆菌gr-1在短期(12h)内均具有一定的抑制白假丝酵母菌效果，但到达24h时的结果显示抑菌效果已经大幅降低。由罗伊氏乳杆菌rc-14和鼠李糖乳杆菌gr-1组成的对照组合物虽然抑制白假丝酵母菌效果能够维持至48h以上，但在12h内的效果却稍逊于单菌。所述乳杆菌组合物由始至终(12-48h)均呈现出良好的抑制白假丝酵母菌效果，远优于四株单菌，也强于对照组合物。
[0100]
6.耐受胃肠液检测
[0101]
将各乳杆菌或组合物分别进行模拟胃、肠液的存活检测。
[0102]
活化各乳杆菌或组合物，于37℃厌氧培养24h后，在4℃条件下4500rpm 离心10min，去上清，pbs洗涤一次。加入培养前等量模拟胃液(sgf)重悬菌体，取0h菌液进行稀释涂板后于37℃厌氧培养48h，统计cfu数，每个浓度 3个平行，剩余菌液置于摇床37℃(100rpm)震荡培养2h，取菌液稀释涂板后于37℃厌氧培养48h，统计cfu数。
[0103]
胃液培养2h的菌液在4℃条件下2500rpm离心10min，去上清，pbs洗涤一次。加入等量模拟肠液混匀。取0h菌液进行稀释涂板后于37℃厌氧培养 48h，统计cfu数，每个浓度3个平行。剩余菌液置于摇床37℃(100rpm)震荡培养3h，取菌液稀释涂板后于37℃厌氧培养48h，统计cfu数。
[0104]
计算公式如下：
[0105]
存活率％＝lg(48h活菌数)/lg(0h活菌数)
×
100％
[0106]
结果如附图4所示，只有lsa-139菌株在ph 2.0的模拟胃液中的存活率低于90％，其余菌株在模拟胃液、模拟肠液中存活率都大于90％，各乳杆菌单菌在ph 2.0的模拟胃液试验中未出现有存活率大于等于100％的情况，但所述乳杆菌组合物在ph 2.0的模拟胃液消化后存活率却大于100％；此外，所述对照组合物在ph2.0模拟胃液2h后存活率降至90％，到达ph 6.8模拟肠液3h后，对模拟肠液的耐受能力也有所减弱，存活率降至97％。因此所述乳杆菌组合物表现出了优于单菌且优于所述对照组合物的耐受性，从而推断所述乳杆菌组合物更易从消化系统到达阴道进行定植。
[0107]
实施例3益生菌组合物安全性评价
[0108]
1.溶血性检测
[0109]
细菌的溶血试验可以反映出细菌是否有致病性，将活化的lsa-410菌株、 lsa-139菌株、lsa-1643菌株和lsa-1663菌株接种传代2次接种于血琼脂平板，阴性对照菌为英诺克李斯特氏菌(listeria innocua)cicc 10417，阳性对照菌为金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)cicc 10473，观察溶血性。检测结果如图5所示，图5a的lsa-139菌株平板、图5b的lsa-1643菌株平板、图5c的 lsa-1663菌株平板、图5d的lsa-410菌株平板均无溶血现象产生，表示4种提取所得的乳杆菌均无致病性，安全性高。
[0110]
2.抗生素敏感性试验
[0111]
根据clsi m45-a3(不常见或苛养菌药敏方法)药敏实验标准，采用微量肉汤稀释法，测定lsa-139菌株、lsa-1643菌株、lsa-1663菌株和lsa-410 菌株对氨苄西林(am)、克林霉素(cm)、达托霉素(dpc)、红霉素(ery)、利奈唑胺(lz)、美罗培南(mrp)、万古霉素(va)的敏感性。检测结果见表5。
[0112]
表5各单菌药敏结果
[0113][0114]
药敏结果显示：lsa-139菌株对检测抗生素均表现为敏感；lsa-1643菌株对氨苄西林、克林霉素、达托霉素、红霉素、利奈唑胺敏感，对美罗培南、万古霉素耐药；lsa-1663菌株对氨苄西林克林霉素、达托霉素、红霉素、利奈唑胺、美罗培南敏感，对万古霉素耐药；lsa-410菌株对氨苄西林、达托霉素、红霉素、利奈唑胺、美罗培南敏感；对克林霉素中介；对万古霉素耐药。
[0115]
实施例4针对细菌性阴道炎女性志愿者口服试验
[0116]
1.试验材料：
[0117]
a组为所述乳杆菌组合物，规格为2g/袋，每袋内含益生菌活菌数不低于 5.0
×
109cfu。
[0118]
b～e组分别为lsa-410菌株冻干粉、lsa-139菌株冻干粉、lsa-1643菌株冻干粉和lsa-1663菌株冻干粉制备而成，规格为2g/袋，每袋内含益生菌活菌数不低于5.0
×
109cfu。
[0119]
f组为安慰剂，由蔓越莓果粉制备而成，规格为2g/袋。
[0120]
g组益生菌食品为蔓越莓益生菌固体饮料(购买自天猫赤尾品牌旗舰店)，有效成分包括罗伊氏乳杆菌rc-14和鼠李糖乳杆菌gr-1，规格为2g/袋，每袋内含益生菌活菌数不低于5.0
×
109cfu。
[0121]
a～f组产品由四川高福记生物科技有限公司代工制备，经过活菌计数，杂菌、霉菌检验合格后，进行人体试验。
[0122]
2.试验方法：
[0123]
对象共计70人，均为女性且有细菌性阴道炎症状。试验详情及风险已告知志愿者，并获得志愿者本人同意。
[0124]
a～g组每组10人，分别服用对应产品，每日2次，每次1袋，连服30天。
[0125]
3.实验结果：
[0126]
1)a～e组试用人群中均未出现呕吐、腹泻、腹痛等不适感。a组有4例试验结束后症状消失，3例症状明显缓解，2例症状轻微缓解。b组有1例试验结束后症状消失，3例试验结束后症状有所缓解。c组有2例试验结束后症状消失。 d组有1例试验结束后症状消失，3例试验结束后症状有所缓解。e组试验结束后有3例症状有所缓解。f组试验结束后有1例轻微缓解，剩下的症状均无改善。 g组试验结束后有3例症状消失，3例症状明显缓解，1例症状轻微缓解。经比较可发现所述乳杆菌组合物表现出比单菌更佳的治疗或改善细菌性阴道炎的作用，且比市售的益生菌组合物效果更好。
[0127]
2)试验前各组随机筛选3人，分别在服用前(d0)、服用第15天(d15)、服用第30天(d30)、断服后5天(d35)及断服后15天(d45)采集阴道分泌物样本进行乳杆菌检测计数，检测结果如图6所示。益生菌服用期间，a组(乳杆菌组合物)志愿者阴道乳杆菌定植量明显增加，定植效果强于各单菌组，且优于g组(对照组合物)志愿者的定植能力；断服后一段时间，各单菌组及对照组合物组乳杆菌含量均有所下降，而a组(乳杆菌组合物)志愿者阴道内仍然能够维持较高乳杆菌活菌数量；而未服用益生菌组志愿者乳杆菌数量变化不大。
[0128]
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。