一种提取肝素钠样品中核酸的方法及组合物与流程

本公开属于核酸提取领域，具体涉及一种肝素钠样本中核酸提取的方法及其组合物。

背景技术：

1、肝素作为一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。临床上可用于血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手术、心脏导管检查、体外循环、血液透析等多种疾病的治疗。同时肝素作为公认的pcr强抑制剂，具有和核酸相近似的特性，会结合聚合酶活性位点抑制pcr。因此含肝素的血液、血浆等生物样品在pcr前需要通过不同的前处理方法来去除肝素带来的影响，防止假阴性的发生，或是要求病人提前终止肝素治疗，使其体内肝素含量降低。目前去除肝素的方法第一种是使用肝素酶消化，此类方法耗时较长，且商品化肝素酶价格较为昂贵，langer等报道利用肝素酶系统用于体外治疗，使用肝素酶固定血液过滤器，通过酶降解实现100％去除肝素(langer r,linhardt rj,cooney cl,klein m,tapper d,hoffberg sm,larsena.1982.an enzymatic system forremoving heparin in extracorporeal therapy.science.217:261–263)。第二种是使用一些介质材料来吸附生物体液中的肝素，如kaminski等人报道利用一种对于ph敏感的京尼平交联壳聚糖微球，可以从水中高效去除肝素，未来有可能应用于生物医学领域(kaminskik,zazakowny k,szczubialka k,nowakowska m.ph-sensitive genipin-cross-linkedchitosan microspheres forheparinremoval.biomacromolecules.2008；9:3127–3132)，再如baydemir等人报道利用分子印迹冷冻凝胶去除血浆中的肝素。第三种则是核酸纯化的方法，可在纯化过程中去除肝素杂质。如cn103952398a所示从肝素制品中提取基因组的方法，整体耗时仅需40min，与前述方法相比，大大缩短时间成本。此外前两种方法成本较高，耗时较长，独特的材料也无法被广泛应用，且这两种方法仅仅去除了样本中的肝素，若需样本中核酸还需要额外的核酸提取试剂盒。

技术实现思路

1、本公开的目的是提出一种可以快速从肝素钠血浆样本中提取病毒核酸的方法，通过特异性的裂解、结合、洗涤、漂洗体系，去除样本中所含有的多种杂质，特别是肝素钠。提取的产物可直接应用于pcr等多种下游应用，同时能够兼容含肝素钠样品在内的多种液体样本，为临床应用提供方便。

2、在第一方面，本公开提供一种液体组合物，所述液体组合物包含缓冲物质、变性剂、表面活性剂和无水乙醇，其中无水乙醇的体积分数为20％-35％。所述液体组合物用于裂解含有肝素钠的血浆样本中的病毒颗粒，释放出病毒dna和/或rna核酸。

3、在一些实施方案中，所述无水乙醇的体积分数为20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％或35％。

4、在一些实施方案中，所述缓冲物质选自三羟甲基氨基甲烷、3-(n-吗啡啉)丙磺酸(即mops)、醋酸钠、柠檬酸钠、碳酸钠中的至少一种。

5、在一些实施方案中，所述变性剂选自异硫氰酸胍、盐酸胍、硫氰酸胍、高氯酸盐、nai、ki、尿素中的至少一种。

6、在一些实施方案中，所述表面活性剂选自triton x-100、吐温-20、吐温-80、np-40、sds、chaps、脱氧胆酸钠、胆酸钠、甜菜碱、peg8000中的至少一种、至少两种或至少三种。

7、在一些实施方案中，所述液体组合物包含三羟甲基氨基甲烷、异硫氰酸胍、吐温-20、triton x-100和无水乙醇，其中无水乙醇的体积分数为20％-35％。在一些实施方案中，所述三羟甲基氨基甲烷浓度为20mm、异硫氰酸胍浓度为2m、吐温-20体积分数为1％、tritonx100体积分数为0.1％，所述无水乙醇的体积分数为24％-32％。在一些实施方案中，所述无水乙醇的体积分数为20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％或35％。

8、在一些实施方案中，所述液体组合物还包含金属离子螯合剂。在一些实施方案中，所述金属离子螯合剂选自edta·2na、edta·4na、edta、柠檬酸钠、egta、hedta中的至少一种。在一些实施方案中，金属离子螯合剂为edta·2na，其浓度为5mm。

9、在一些实施方案中，所述液体组合物还包含甜菜碱，所述甜菜碱的浓度为0.1mm。

10、在一些实施方案中，所述液体组合物还包含peg8000，所述peg8000的体积分数为0.005％。

11、在一些实施方案中，所述液体组合物的ph为7.0-7.5。在一些实施方案中，所述液体组合物的ph为7.3。

12、在第二方面，本公开提供一种液体组合物，所述液体组合物包含缓冲物质、金属离子螯合剂、变性剂、表面活性剂和无水乙醇，其中无水乙醇的体积分数为15％-45％。所述液体组合物用于清除残留的蛋白质等杂质。

13、在一些实施方案中，所述无水乙醇体积分数为15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％或45％。

14、在一些实施方案中，所述缓冲物质选自三羟甲基氨基甲烷、3-(n-吗啡啉)丙磺酸(即mops)、醋酸钠、柠檬酸钠、碳酸钠中的至少一种。

15、在一些实施方案中，所述金属离子螯合剂选自edta·2na、edta·4na、edta、柠檬酸钠、egta、hedta中的至少一种。在一些实施方案中，金属离子螯合剂为edta·2na，其浓度为10mm。

16、在一些实施方案中，所述变性剂选自异硫氰酸胍、盐酸胍、硫氰酸胍、高氯酸盐、nai、ki、尿素中的至少一种。

17、在一些实施方案中，所述表面活性剂选自triton x-100、吐温-20、吐温-80、np-40、sds、chaps、脱氧胆酸钠、胆酸钠中的至少一种、至少两种或至少三种。

18、在一些实施方案中，所述液体组合物包含三羟甲基氨基甲烷、edta·2na盐、盐酸胍、吐温-20和无水乙醇，其中，无水乙醇的体积分数为15％-45％。在一些实施方案中，所述三羟甲基氨基甲烷浓度为20mm、edta·2na盐浓度为10mm、盐酸胍浓度为2m、吐温-20体积分数为0.002％，所述无水乙醇的体积分数为15％-45％。在一些实施方案中，所述无水乙醇体积分数为15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％或45％。

19、在一些实施方案中，所述液体组合物ph为7.3-7.7。在一些实施方案中，所述液体组合物的ph为7.5。

20、在第三方面，本公开提供一种试剂盒，所述试剂盒包含第一方面所述液体组合物和/或第二方面所述液体组合物。

21、在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于漂洗吸附柱的液体组合物，所述液体组合物包含三羟甲基氨基甲烷、edta·2na盐、盐酸胍、氯化钠和乙醇。在一些实施方案中，所述三羟甲基氨基甲烷浓度为20mm、edta·2na盐浓度为0.5mm、盐酸胍浓度为100mm、氯化钠浓度为50mm、乙醇体积分数为80％。在一些实施方案中，用于漂洗吸附柱的液体组合物ph为8.0。

22、在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于洗脱核酸的液体组合物，所述液体组合物包含三羟甲基氨基甲烷和nuclease-free water。在一些实施方案中，所述三羟甲基氨基甲烷浓度为10mm，所述液体组合物ph为6.0。

23、在第四方面，本公开提供第三方面所述试剂盒在含肝素钠的样本上提取病毒rna的应用。在一些实施方案中，提供第三方面所述试剂盒在含肝素钠的样本上共同提取dna和rna核酸的应用。

24、在第五方面，本公开提供一种样本核酸提取方法，所述方法包含样本裂解、核酸结合吸附柱、洗涤吸附柱、漂洗吸附柱、洗脱核酸，其中使用上述第一方面所述液体组合物裂解样本和/或使用上述第二方面所述液体组合物洗涤吸附柱。

25、在一些实施方案中，所述样本是含有肝素钠的血浆样本。

26、在一些实施方案中，所述样本核酸提取方法用于提取样本中的病毒rna。在一些实施方案中，所述样本核酸提取方法用于共同提取样本中的dna和rna。

27、本公开的方法可有效富集病毒核酸，对于肝素钠去除效果较优，降低了肝素钠对pcr或qpcr的扩增效率的影响。提取产物可直接应用于下游逆转录、pcr、荧光定量pcr、rt-pcr、rt-qpcr、二代测序、生物芯片分析等应用。

28、名称解释

29、本文中“缓冲物质”指能够维持溶液ph环境，包含三羟甲基氨基甲烷、3-(n-吗啡啉)丙磺酸(即mops)、醋酸钠、柠檬酸钠、碳酸钠等。

30、本文中“变性剂”指具有裂解病毒颗粒、变性蛋白、抑制rnase、提供高盐环境的作用的变性剂，能够促使病毒dna和/或rna与吸附膜结合，包含异硫氰酸胍、盐酸胍、硫氰酸胍、高氯酸盐、nai、ki、尿素等。

31、本文中“表面活性剂”指具有溶解、变性样本中蛋白质的作用，包含triton x-100、吐温-20、吐温-80、np-40、sds、chaps、脱氧胆酸钠、胆酸钠、甜菜碱、peg8000等。

32、本文中“金属离子螯合剂”指具有螯合金属离子作用的物质，包含edta·2na、edta·4na、edta、柠檬酸钠、egta、hedta等。