一株贝莱斯芽孢杆菌菌株及其在制备凝乳酶中的应用

本发明属于生物，涉及一株贝莱斯芽孢杆菌菌株及其在制备凝乳酶中的应用。

背景技术：

1、凝乳酶是奶酪生产过程中的关键酶，它可能会影响奶酪的产量、质地和风味。小牛凝乳酶是使用最广泛的牛奶凝固剂，取自哺乳小牛的第四胃。然而，由于小牛凝乳酶的产量有限和奶酪消费量的增加，使用小牛凝乳酶替代品变得必要。现有技术中已经探索了来自动物、植物、微生物和来自基因工程生物体的重组凝乳酶。然而，这些替代品仍然存在一些问题，即凝乳酶和动物胃蛋白酶对素食不友好。植物蛋白酶通常具有过度的蛋白水解活性，这会导致最终产品中产生苦味并限制奶酪生产。因此，寻找一种合适的替代品来替代奶酪制作中的凝乳酶是非常有必要的。

2、据报道，一些来自真菌的肽酶具有凝乳活性。与真菌凝乳酶相比，细菌凝乳酶由于生产成本更低、生化更多样化和更容易基因改造而更具潜力。此外，细菌深层发酵更容易控制，材料利用率更高。目前还没有关于贝莱斯芽孢杆菌生产凝乳酶的相关报道。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一株贝莱斯芽孢杆菌菌株及其在制备凝乳酶中的应用。

2、本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)yh-1，已于2022年09 月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为cgmcc no.25636。

3、本发明还保护贝莱斯芽孢杆菌yh-1在制备凝乳酶中的应用。

4、所述应用中，通过发酵培养贝莱斯芽孢杆菌yh-1，获得凝乳酶。

5、发酵培养贝莱斯芽孢杆菌yh-1的步骤具体可为：将贝莱斯芽孢杆菌yh-1接种至优化后培养基，30℃、140r/min振荡培养48小时。

6、发酵培养贝莱斯芽孢杆菌yh-1的步骤具体可为：将贝莱斯芽孢杆菌yh-1种子液以4％的接种量接种至优化后培养基，30℃、140r/min振荡培养48小时。

7、发酵培养贝莱斯芽孢杆菌yh-1的步骤具体可为：将贝莱斯芽孢杆菌yh-1种子液以4％的接种量接种至优化后培养基(每个250ml三角瓶装50ml培养基)，30℃、 140r/min振荡培养48小时。

8、优化后培养基(自然ph)：含酵母粉7g/l、蛋白胨15g/l、果糖20g/l、k2hpo4·3h2o1g/l，余量为水。

9、所述贝莱斯芽孢杆菌yh-1种子液的制备方法具体可为：将贝莱斯芽孢杆菌yh-1接种至液体lb培养基，30℃、120r/min振荡培养，得到种子液。

10、所述贝莱斯芽孢杆菌yh-1种子液的od600nm值为0.64-0.66。

11、所述应用中，发酵培养贝莱斯芽孢杆菌yh-1后，离心收集上清液，即为含有凝乳酶的粗酶液。所述离心参数具体可为：4℃、10000×g离心30min。

12、所述应用中，获得粗酶液后，从粗酶液中纯化获得凝乳酶。

13、所述纯化方法依次包括如下步骤：硫酸铵沉淀和阴离子交换柱纯化。

14、所述硫酸铵沉淀为60％饱和度硫酸铵沉淀。

15、所述硫酸铵沉淀为4℃环境60％饱和度硫酸铵沉淀。

16、所述硫酸铵沉淀的参数为：4℃静置12h。

17、阴离子交换柱纯化的参数如下：

18、阴离子层析柱：填充物为deae-琼脂糖凝胶ff，柱子型号为2.6×40cm；

19、洗脱过程：先用tris-hcl缓冲液平衡，然后上样，然后用tris-hcl缓冲液洗脱。

20、洗脱流速具体可为3ml/min。

21、洗脱过程中收集保留时间为第48-72min的过柱后溶液。

22、洗脱过程中收集保留体积为144-216ml的过柱后溶液。

23、上样液的制备方法包括如下步骤：完成硫酸铵沉淀后，离心收集沉淀；用tris-hcl缓冲液溶解沉淀，然后转移至透析袋(截留分子量为8000-14000da)中，将透析袋置于tris-hcl缓冲液中透析，然后收集透析袋中的液相，冷冻干燥，得到冻干粉；将冻干粉溶解于tris-hcl缓冲液，然后用0.45μm滤膜过滤，收集滤液，即为上样液。

24、上样液的制备方法包括如下步骤：完成硫酸铵沉淀后，4℃、10000×g离心30min，收集沉淀；用tris-hcl缓冲液溶解沉淀，然后转移至透析袋(截留分子量为 8000-14000da)中，将透析袋置于tris-hcl缓冲液中4℃透析48h，然后收集透析袋中的液相，冷冻干燥，得到冻干粉；将冻干粉溶解于tris-hcl缓冲液，使其浓度为 10mg/ml，然后用0.45μm滤膜过滤，收集滤液，即为上样液。

25、本发明还保护贝莱斯芽孢杆菌yh-1的发酵液。

26、所述发酵液的制备方法可为：将贝莱斯芽孢杆菌yh-1接种至优化后培养基，30℃、140r/min振荡培养48小时，离心收集上清液，即为发酵液。

27、所述发酵液的制备方法可为：将贝莱斯芽孢杆菌yh-1种子液以4％的接种量接种至优化后培养基，30℃、140r/min振荡培养48小时，离心收集上清液，即为发酵液。

28、所述发酵液的制备方法可为：将贝莱斯芽孢杆菌yh-1种子液以4％的接种量接种至优化后培养基(每个250ml三角瓶装50ml培养基)，30℃、140r/min振荡培养48 小时，离心收集上清液，即为发酵液。

29、所述离心参数具体可为：4℃、10000×g离心30min。

30、优化后培养基(自然ph)：含酵母粉7g/l、蛋白胨15g/l、果糖20g/l、k2hpo4·3h2o1g/l，余量为水。

31、贝莱斯芽孢杆菌yh-1种子液的制备方法具体可为：将贝莱斯芽孢杆菌yh-1接种至液体lb培养基，30℃、120r/min振荡培养，得到种子液。

32、所述贝莱斯芽孢杆菌yh-1种子液的od600nm值为0.64-0.66。

33、本发明还保护所述发酵液在制备凝乳酶中的应用。

34、用发酵液制备凝乳酶的方法包括如下步骤：从发酵液中纯化获得凝乳酶。

35、所述纯化方法依次包括如下步骤：硫酸铵沉淀和阴离子交换柱纯化。

36、所述硫酸铵沉淀为60％饱和度硫酸铵沉淀。

37、所述硫酸铵沉淀为4℃环境60％饱和度硫酸铵沉淀。

38、所述硫酸铵沉淀的参数为：4℃静置12h。

39、阴离子交换柱纯化的参数如下：

40、阴离子层析柱：填充物为deae-琼脂糖凝胶ff，柱子型号为2.6×40cm；

41、洗脱过程：先用tris-hcl缓冲液平衡，然后上样，然后用tris-hcl缓冲液洗脱。

42、洗脱流速具体可为3ml/min。

43、洗脱过程中收集保留时间为第48-72min的过柱后溶液。

44、洗脱过程中收集保留体积为144-216ml的过柱后溶液。

45、上样液的制备方法包括如下步骤：完成硫酸铵沉淀后，离心收集沉淀；用tris-hcl缓冲液溶解沉淀，然后转移至透析袋(截留分子量为8000-14000da)中，将透析袋置于tris-hcl缓冲液中透析，然后收集透析袋中的液相，冷冻干燥，得到冻干粉；将冻干粉溶解于tris-hcl缓冲液，然后用0.45μm滤膜过滤，收集滤液，即为上样液。

46、上样液的制备方法包括如下步骤：完成硫酸铵沉淀后，4℃、10000×g离心30min，收集沉淀；用tris-hcl缓冲液溶解沉淀，然后转移至透析袋(截留分子量为 8000-14000da)中，将透析袋置于tris-hcl缓冲液中4℃透析48h，然后收集透析袋中的液相，冷冻干燥，得到冻干粉；将冻干粉溶解于tris-hcl缓冲液，使其浓度为 10mg/ml，然后用0.45μm滤膜过滤，收集滤液，即为上样液。

47、本发明还保护所述发酵液的应用，为如下(a)或(b)或(c)：

48、(a)作为凝乳酶；

49、(b)作为液态奶凝固剂；

50、(c)以液态奶为原料制备奶酪。

51、本发明还保护一种制备凝乳酶的方法，包括如下步骤：发酵培养贝莱斯芽孢杆菌yh-1，得到发酵液。

52、所述发酵液的制备方法可为：将贝莱斯芽孢杆菌yh-1接种至优化后培养基，30℃、140r/min振荡培养48小时，离心收集上清液，即为发酵液。

53、所述发酵液的制备方法可为：将贝莱斯芽孢杆菌yh-1种子液以4％的接种量接种至优化后培养基，30℃、140r/min振荡培养48小时，离心收集上清液，即为发酵液。

54、所述发酵液的制备方法可为：将贝莱斯芽孢杆菌yh-1种子液以4％的接种量接种至优化后培养基(每个250ml三角瓶装50ml培养基)，30℃、140r/min振荡培养48 小时，离心收集上清液，即为发酵液。

55、所述离心参数具体可为：4℃、10000×g离心30min。

56、优化后培养基(自然ph)：含酵母粉7g/l、蛋白胨15g/l、果糖20g/l、k2hpo4·3h2o1g/l，余量为水。

57、贝莱斯芽孢杆菌yh-1种子液的制备方法具体可为：将贝莱斯芽孢杆菌yh-1接种至液体lb培养基，30℃、120r/min振荡培养，得到种子液。

58、所述贝莱斯芽孢杆菌yh-1种子液的od600nm值为0.64-0.66。

59、所述方法还包括如下步骤：从发酵液中纯化得到凝乳酶。

60、所述纯化方法依次包括如下步骤：硫酸铵沉淀和阴离子交换柱纯化。

61、所述硫酸铵沉淀为60％饱和度硫酸铵沉淀。

62、所述硫酸铵沉淀为4℃环境60％饱和度硫酸铵沉淀。

63、所述硫酸铵沉淀的参数为：4℃静置12h。

64、阴离子交换柱纯化的参数如下：

65、阴离子层析柱：填充物为deae-琼脂糖凝胶ff，柱子型号为2.6×40cm；

66、洗脱过程：先用tris-hcl缓冲液平衡，然后上样，然后用tris-hcl缓冲液洗脱。

67、洗脱流速具体可为3ml/min。

68、洗脱过程中收集保留时间为第48-72min的过柱后溶液。

69、洗脱过程中收集保留体积为144-216ml的过柱后溶液。

70、上样液的制备方法包括如下步骤：完成硫酸铵沉淀后，离心收集沉淀；用tris-hcl缓冲液溶解沉淀，然后转移至透析袋(截留分子量为8000-14000da)中，将透析袋置于tris-hcl缓冲液中透析，然后收集透析袋中的液相，冷冻干燥，得到冻干粉；将冻干粉溶解于tris-hcl缓冲液，然后用0.45μm滤膜过滤，收集滤液，即为上样液。

71、上样液的制备方法包括如下步骤：完成硫酸铵沉淀后，4℃、10000×g离心30min，收集沉淀；用tris-hcl缓冲液溶解沉淀，然后转移至透析袋(截留分子量为 8000-14000da)中，将透析袋置于tris-hcl缓冲液中4℃透析48h，然后收集透析袋中的液相，冷冻干燥，得到冻干粉；将冻干粉溶解于tris-hcl缓冲液，使其浓度为 10mg/ml，然后用0.45μm滤膜过滤，收集滤液，即为上样液。

72、本发明还保护所述方法制备得到的凝乳酶。

73、所述方法制备得到的凝乳酶，km和vmax值分别为8.58mg/ml和15.65u/min。

74、所述方法制备得到的凝乳酶，最适温度和最适ph分别为55℃和5.5。

75、所述方法制备得到的凝乳酶，在ph 6-7范围内稳定。

76、所述方法制备得到的凝乳酶，在低于50℃的温度下稳定。

77、本发明还保护所述凝乳酶的应用，为如下(a)或(b)或(c)：

78、(a)作为凝乳酶；

79、(b)作为液态奶凝固剂；

80、(c)以液态奶为原料制备奶酪。

81、所述tris-hcl缓冲液为ph6.8、50mm的tris-hcl缓冲液。

82、本发明还保护一种试剂盒，包括贝莱斯芽孢杆菌yh-1或以上任一所述发酵液或以上任一所述凝乳酶。

83、所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)或(c)或(d)：

84、(a)作为凝乳酶；

85、(b)作为液态奶凝固剂；

86、(c)以液态奶为原料制备奶酪；

87、(d)制备凝乳酶。

88、本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌yh-1，可通过发酵制备凝乳酶。本发明提供的凝乳酶凝乳活力高且蛋白水解活力低。本发明首次发现了可以发酵制备凝乳酶的贝莱斯芽孢杆菌，可作为小牛凝乳酶的替代品用于奶酪制备以及其他相关产业。