人纤连蛋白III型蛋白支架的制作方法

本公开涉及纤连蛋白iii型(fn3)域分子以及制备和使用所述分子的方法。

背景技术：

1、当需要对靶分子具有高亲和力和特异性时，单克隆抗体是最广泛使用的一类治疗蛋白质。然而，非抗体蛋白质具有可被工程化以结合所需靶分子(通常称为蛋白支架)的相对明确的三维结构，由于其尺寸小、缺乏二硫键、高稳定性、以及在原核宿主中表达的能力而可能比传统抗体具有优势。这些支架典型地含有一个或多个易于进行特定或随机序列变异的区域，并且通常进行这种序列随机化以产生可从中选择所需产物的蛋白质文库。新型纯化方法易于应用；支架很容易与药物/毒素缀合，有效渗透至组织中，并且可形成多特异性结合剂(binz和pluckthun,curr opin biotechnol,16,459-469,2005；skerra,j malrecognit,13,167-187,2000)。

2、一种这样的蛋白支架是在多种蛋白质中鉴定的纤连蛋白iii型(fn3)域，其具有特征性的三级结构，其中6个环由7条β链连接。特别是三个环，fg、bc和de环，在结构上类似于抗体的互补决定区(cdr)。这些环已被随机化以生成fn3域支架文库，以成功选择许多不同靶标的特异性结合剂，同时保留重要的生物物理特性(getmanova等人,chem biol,13,549-556,2006；hackel等人,j mol biol,381,1238-1252,2008；karatan等人,chem biol,11,835-844,2004；koide等人,j mol biol,284,1141-1151,1998；koide等人,proc natl acadsci us a,104,6632-6637,2007；parker等人,protein eng des sel,18,435-444,2005；xu等人,chemistry&biology,9,933-942,2002)。

3、需要替代的结合域，其可用作可促进治疗剂(例如基于寡核苷酸的治疗剂)的递送的靶向部分，或通过与靶分子结合而具有直接治疗效果。本公开提供了此类改进的蛋白质。

技术实现思路

1、在一些实施方案中，提供了包含多个纤连蛋白iii型模块(fn3)域(多肽)的文库，所述文库具有包含多样化cβ链、cd环、dβ链、fβ链、fg环和gβ链的多样化c-cd-d-f-fg-g替代表面，其中所述多肽包含与seq id no:44的氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％同一的氨基酸序列；其中与seq id no:24相比，所述多个多肽在cβ链、cd环、dβ链、fβ链、fg环或gβ链中的一者或多者或每一者中包含至少一个突变氨基酸残基，以形成具有多样化c-cd-d-f-fg-g替代表面的fn3域文库。

2、在一些实施方案中，提供了产生本文所述的文库的方法。

3、在一些实施方案中，提供了制备人纤连蛋白iii型(fn3)域文库的方法，其中所述文库包含多样化c-cd-d-f-fg-g替代表面，其包含多样化cβ链、cd环、dβ链、fβ链、fg环和gβ链中的一者或多者或每一者，所述方法包含提供具有与seq id no:44的氨基酸序列至少80％、85％或90％同一的氨基酸序列的参考fn3域多肽；通过使以下任一域的至少一个残基突变将多样性引入参考fn3域多肽中：cβ链、cd环、dβ链、fβ链、fg环和gβ链残基，以形成具有多样化c-cd-d-f-fg-g替代表面的人fn3域文库。

4、在一些实施方案中，提供了通过本文所述的方法产生的文库。

5、在一些实施方案中，提供了获得包含人纤连蛋白iii型模块(fn3)域的蛋白支架的方法，所述域具有特异性结合于靶分子的多样化c-cd-d-f-fg-g替代表面，所述方法包括使文库与靶分子接触或用靶分子淘选文库并分离以预定亲和力特异性结合于靶分子的蛋白支架。

6、在一些实施方案中，提供了获得包含纤连蛋白iii型模块(fn3)域的多肽的方法，所述域具有结合或特异性结合靶分子的多样化c-cd-d-f-fg-g替代表面，所述方法包括使本文公开的文库与靶分子接触或用靶分子淘选(筛选)本文公开的文库并分离结合或特异性结合于靶分子的多肽。

技术特征：

1.一种包含多个纤连蛋白iii型模块(fn3)域(多肽)的文库，所述文库具有包含多样化cβ链、cd环、dβ链、fβ链、fg环和gβ链的多样化c-cd-d-f-fg-g替代表面，其中所述多肽包含以下氨基酸序列：

2.如权利要求1所述的文库，其中每个x独立地是除甲硫氨酸或半胱氨酸之外的任何氨基酸。

3.如权利要求1或2所述的文库，其中与seq id no:24相比，所述多肽在所述cβ链、所述cd环、所述dβ链、所述fβ链、所述fg环或所述gβ链中的一者或多者或每一者中包含至少一个突变氨基酸残基，以形成具有所述多样化c-cd-d-f-fg-g替代表面的所述fn3域文库。

4.如权利要求1-3中任一项所述的文库，其中所述多个多肽在对应于seq id no:24的位置32、34、36、38、39、40、41、46、48、68、70、72、78、79、81、85和/或87的位置处具有一个或多个突变(例如取代、插入或缺失)。

5.如权利要求1-4中任一项所述的文库，其中所述多样化cβ链具有tgyxvxyxe(seq idno:45)的氨基酸序列，其中每个x独立地是除甲硫氨酸或半胱氨酸之外的任何氨基酸。

6.如权利要求1-5中任一项所述的文库，其中所述多样化cd环具有xxxxge(seq id no:46)的氨基酸序列，其中每个x独立地是除甲硫氨酸或半胱氨酸之外的任何氨基酸。

7.如权利要求1-6中任一项所述的文库，其中所述多样化dβ链具有wkxvxvp(seq idno:47)的氨基酸序列，其中每个x独立地是除甲硫氨酸或半胱氨酸之外的任何氨基酸。

8.如权利要求1-7中任一项所述的文库，其中所述多样化fβ链具有teyxfxvxav(seq idno:48)的氨基酸序列，其中每个x独立地是除甲硫氨酸或半胱氨酸之外的任何氨基酸。

9.如权利要求1-8中任一项所述的文库，其中所述多样化fg环具有ngaxxg(seq id no:49)的氨基酸序列，其中每个x独立地是除甲硫氨酸或半胱氨酸之外的任何氨基酸。

10.如权利要求1-9中任一项所述的文库，其中所述多样化gβ链具有氨基酸序列xpsqxvxvtt(seq id no:50)，其中每个x独立地是除甲硫氨酸或半胱氨酸之外的任何氨基酸。

11.如权利要求1-10中任一项所述的文库，其中所述文库包含氨基酸序列，所述氨基酸序列具有与选自由以下组成的组的序列至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一或同一的氨基酸序列：seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42和43。

12.如权利要求1-11中任一项所述的文库，其中：

13.一种产生权利要求1-12中任一项所述的文库的方法，所述方法包括表达编码所述多个多肽的多核苷酸。

14.一种制备具有多样化c-cd-f-fg-g替代表面的纤连蛋白iii型模块(fn3)域的文库的方法，所述替代表面包含多样化cβ链、cd环、fβ链、fg环和g-β链中的一者或多者或每一者，所述方法包括

15.一种通过权利要求13或14所述的方法产生的文库。

16.一种获得包含纤连蛋白iii型模块(fn3)域的多肽的方法，所述域具有结合或特异性结合于靶分子的多样化c-cd-d-f-fg-g替代表面，所述方法包括使权利要求1-12中任一项所述的文库与所述靶分子接触并分离结合或特异性结合于所述靶分子的所述多肽。

17.一种多肽，所述多肽具有与选自由以下组成的组的序列至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一或同一的氨基酸序列：seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42和43。

18.一种多肽，所述多肽包含以下氨基酸序列：

19.如权利要求18所述的多肽，其中每个x独立地是除甲硫氨酸或半胱氨酸之外的任何氨基酸。

20.一种多肽，所述多肽包含以下氨基酸序列：

21.如权利要求20所述的多肽，其中每个x独立地是除甲硫氨酸或半胱氨酸之外的任何氨基酸。

22.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求17-21所述的多肽。

23.一种编码权利要求22所述的多肽的核酸分子。

24.一种编码权利要求1-12中任一项所述的多肽文库的多个核酸分子。

25.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求24所述的核酸分子。

技术总结
基于具有替代结合表面设计的纤连蛋白III型(FN3)域的蛋白支架和支架文库、编码所述蛋白支架的分离的核酸、载体、宿主细胞、其制备方法以及作为用于治疗和诊断疾病和病症的治疗分子的用途。

技术研发人员：R·V·斯旺森,Z·德鲁齐娜,忻尧,K·奥尼尔
受保护的技术使用者：ARO生物疗法公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17