靶向敲除CD70基因的sgRNA组合物及其应用的制作方法

本发明涉及基因编辑领域，具体涉及靶向敲除cd70基因的sgrna组合物及其应用。

背景技术：

1、crispr-cas9是继zfn、talens等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术，是现有基因编辑和基因修饰里面效率最高、最简便、成本最低的技术之一，是当今最主流的基因编辑系统。crisrp-cas9系统的基因组筛选功能具有高特异性和不可逆性的优势，在基因组筛选中得到了广泛的应用。该技术就是通过人工设计的sgrna（guide rna）来识别目的基因组序列，并引导 cas9 蛋白酶进行有效切割 dna 双链，形成双链断裂。在通常情况下，细胞会采用高效的非同源末端连接方式（nhej）对断裂的dna进行修复。但是，在修复过程中通常会发生碱基插入或缺失的错配现象，造成移码突变，使靶标基因失去功能，从而实现基因敲除。

2、肾癌，又称肾细胞癌，是泌尿系统中恶性程度较高的肿瘤，也是最常见的肿瘤之一，在我国泌尿生殖系统肿瘤中占第二位，占成人恶性肿瘤的2%～3%、小儿恶性肿瘤的20%左右。肾癌的治疗方法主要是手术切除、靶向治疗药物和免疫疗法。目前cd70被认为是肾癌的新型特异性肿瘤标志物。因此，cd70是肿瘤靶向和免疫治疗的良好靶点。目前，已经有多种靶向cd70的药物在研，包括car-t细胞、单抗药物和adc等。

3、cd70是一种ⅱ型跨膜蛋白，主要表达于活化的t细胞、b细胞及成熟的树突状细胞。cd70受体为cd27，cd70与cd27作用可以促进t细胞和b细胞的活化、增殖及分化，并调节免疫应答。在正常情况下，高表达于活化的t细胞和b细胞表面，在免疫应答晚期随着抗原刺激的减少其表达下调，表达时间短。但在病理情况下，cd70高表达于多种肿瘤细胞，肿瘤细胞通过表达cd70结合t细胞受体cd27，慢性的共刺激导致t细胞表达pd-1，tim-3等免疫检查点，从而导致免疫功能耗竭。cd70在肿瘤中的高表达可能暗示了肿瘤利用cd70来控制表达cd27的肿瘤浸润淋巴细胞，从而发生免疫逃逸。cd70的异常表达与肿瘤的发生发展及患者的不良预后显著相关。cd70在多种恶性肿瘤尤其是肾癌中表达量高且阳性检出率高，已成为治疗肾癌的兼具有效性和安全性的潜力靶点。针对cd70为靶点的car-t细胞治疗是肾癌治疗的一个热点。

4、根据查询clinicaltrials，与cd70 car-t相关的有多家在研，比如浙江大学和yake biotechnology、shenzhen geno-immune medical institute、crisprtherapeutics、allogene therapeutics。适应症主要为肾细胞癌，其他也包括急性髓系白血病非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤以及其他b细胞恶性肿瘤等血液肿瘤。目前尚无靶向cd70的相关产品上市，但部分研究已经进入临床阶段，主要的适应症为血液肿瘤和肾癌。据中国国家药品监督管理局药品审评中心（cde）和美国食品药品监督管理局（fda）显示，目前全球有三款cd70 car-t细胞治疗产品获得ind批准进入注册临床以探索实体瘤的治疗。

5、靶向cd70的car-t细胞治疗产品在进行体内外功能验证时，需要评估不同来源的cd70 car-t细胞对肾癌细胞系和小鼠肿瘤模型的抗肿瘤活性。常用的肾癌细胞系有achn细胞，源自一名22岁患有肾细胞腺癌的白人男性的胸腔积液，是剪切过的人腺病毒5（ad5）转染的人胚肾细胞形成的永生化细胞。在体内研究中，常使用achn细胞构建小鼠肾癌模型，用于探索肾癌治疗方法的研究。cd70在achn中高表达，可被cd70 car-t细胞靶向识别，是体外功能验证时理想的肾癌细胞系。在评估cd70 car-t细胞对achn细胞的特异性抗肿瘤活性时，我们需要从正反面来进行验证，既要证明cd70 car-t细胞对achn细胞的杀伤作用，同时要证明当cd70在achn细胞中不再表达时，cd70 car-t细胞对achn细胞的杀伤作用将不复存在。因此要建立cd70基因敲除的achn细胞系。现有技术公开了一些靶向敲除cd70的sgrna，而目前未见如本技术能高效敲除achn细胞cd70基因的sgrna组合物产品。

技术实现思路

1、本发明提供一种靶向敲除cd70基因的sgrna组合物及其应用。

2、第一方面，本发明提供一种对细胞内cd70基因进行基因编辑的sgrna组合物，所述sgrna组合物包含靶向cd70的靶向序列分别为seq id no:1-3的三种sgrna。

3、在一个或多个实施方案中，所述sgrna组合物包含seq id no:4-6所示的三种sgrna。

4、在一个或多个实施方案中，所述sgrna组合物中seq id no:4-6所示的三种sgrna的摩尔百分比为(0.000001%-99.999999%):(0.000001%-99.999999%):(0.000001%-99.999999%)；在一些实施方案中，摩尔百分比为(40%-60%):(40%-60%):(40%-60%)；在一些实施方案中，摩尔百分比为50%:50%:50%。

5、在一个或多个实施方案中，所述sgrna是经修饰的。优选地，所述修饰为核苷酸修饰、核苷酸间修饰、5’端修饰和3’端修饰、糖修饰、糖-核苷酸间连接键修饰中的一种或几种。优选地，所述修饰为甲基化修饰、甲氧基修饰、氟化修饰或硫代修饰中的一种或几种。

6、第二方面，本发明提供一种对细胞内cd70基因进行基因编辑的组合物，包含：

7、(i)本文任一实施方案所述的sgrna组合物中的三种sgrna；或，含有编码本文任一实施方案所述的sgrna组合物中的三种sgrna的核酸；和

8、(ii)含有引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域（guide nucleotide sequence-programmable dna binding protein domain）的蛋白；或，含有编码所述含有引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的蛋白的核酸。

9、在一个或多个实施方案中，所述引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域来源于cas核酸酶。优选地，所述核酸酶选自cas9、cas3、cas8a、cas8b、cas10d、cse1、csy1、csn2、cas4、cas10、csm2、cmr5、fok1、cpf1中的一种或几种。更优选的，所述cas9选自来源于肺炎链球菌、化脓性链球菌或嗜热链球菌的cas9。

10、第三方面，本发明提供一种对细胞内cd70基因进行基因编辑的方法，所述方法包括步骤：将含有引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的蛋白和本文任一实施方案所述的sgrna组合物导入细胞、对cd70基因进行编辑，所述sgrna组合物引导所述含有引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的蛋白对cd70基因进行切割并形成断裂位点。

11、在一个或多个实施方案中，所述引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域来源于cas核酸酶。优选地，所述核酸酶选自cas9、cas3、cas8a、cas8b、cas10d、cse1、csy1、csn2、cas4、cas10、csm2、cmr5、fok1、cpf1中的一种或几种。更优选的，所述cas9选自来源于肺炎链球菌、化脓性链球菌或嗜热链球菌的cas9。

12、在一个或多个实施方案中，将含有引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的蛋白和sgrna组合物导入细胞的方式选自电穿孔、载体转化、转染、热休克、转导、基因枪或显微注射。优选地，采用电穿孔的方式。

13、第四方面，本发明提供本文任一实施方案所述的方法制备得到的基因编辑的细胞。

14、第五方面，本发明提供本文任一实施方案所述的sgrna组合物、本文任一实施方案所述的组合物在制备对细胞内cd70进行基因编辑的产品中的应用。

15、本发明的有益效果在于：本发明提供的sgrna组合物能够高效引导cas核酸酶结合靶向cd70基因的靶序列，具有敲除效率高的优势，可以高效构建cd70基因不表达的细胞系，有助于开展cd70 car-t细胞体外功能实验。