用于定量检测副猪嗜血杆菌的荧光PCR引物探针组、试剂盒和方法与流程

本发明涉及细菌检测，具体地，涉及用于定量检测副猪嗜血杆菌的荧光pcr引物探针组、试剂盒和方法。

背景技术：

1、副猪嗜血杆菌病又称多发性纤维素性浆膜炎和关节炎，也称格拉泽氏病(glaesser’s disease)。该病是由副猪嗜血杆菌（haemophilus parasuis, hps）引起的，这种细菌在环境中普遍存在。无论是健康的猪群还是患病的猪群中，都能提取到该细菌。该病在临床上是以体温升高、关节肿胀、呼吸困难、多发性浆膜炎、关节炎和高死亡率为特征的传染病，严重危害仔猪和青年猪的健康。猪是该病的唯一宿主，该病可以影响2周龄到4月龄的猪，主要在断奶前后和保育阶段发病，通常见于5-8周龄的猪，发病率一般在10%-15%，严重时死亡率可达50%的急性病例，往往首发于膘情良好的猪。病猪可通过呼吸系统进行排毒，当猪群中存在繁殖呼吸综合症、流感或地方性肺炎的情况下，该病更容易发生。生存环境差、断水、断奶、转群、混群、运输等情况也是影响该病病发的诱因之一。副猪嗜血杆菌病已经在全球范围影响着养猪业的发展，给养猪业带来巨大的经济损失。

2、由于该细菌常与其他的细菌和病毒混合感染，且各血清型之间交叉保护力弱，疫苗免疫效果差，从而导致该病的大面积流行；且目前该病尚无有效的治疗方法，这给养猪业造成巨大影响。实时荧光定量pcr(qpcr)方法由于操作简单、检测快速是目前hps检测中最为常用的方法。于此同时，为了满足hps检测的市场需求，一些企业利用荧光定量pcr技术，开发了用于hps检测的商品化试剂盒。目前，有关副猪嗜血杆菌的荧光定量pcr检测方法的引物探针设计多选择在细菌16s rdna序列上，这对巴斯德氏菌科嗜血杆菌属其它细菌的区分度不高，造成检测的特异性较差，并且其细菌的最低检出限多数为100 copies/μl及以上，灵敏度偏低。同时这些试剂在一定程度上存在操作过程复杂、检测耗时长、准确性低以及抗污染能力差等缺陷，很难满足hps核酸检测的需求。

3、为了更好的满足hps快速、早期精准检测的需求，开发建立一种超快速、高精度qpcr检测方法，从而达到有效预防和阻断hps的传播，控制疫情流行传播，促进养猪业的健康发展尤为重要。

技术实现思路

1、针对上述现有技术，本发明的目的在于克服现有技术中对于副猪嗜血杆菌的检测试剂在一定程度上存在操作过程复杂、检测耗时长、准确性低以及抗污染能力差等缺陷，很难满足hps核酸检测需求的问题，从而提供一种能够快速、灵敏、准确地实现副猪嗜血杆菌检测的用于定量检测副猪嗜血杆菌的荧光pcr引物探针组、试剂盒和方法。

2、为了实现上述目的，本发明提供了一种用于定量检测副猪嗜血杆菌的荧光pcr引物探针组，所述荧光pcr引物探针组包括一组引物对，以及如seq id no:5所示的特异性探针；且，

3、所述引物对选自如seq id no:1和seq id no:2所示的第一引物对，或，如seq idno:3和seq id no:4所示的第二引物对。

4、进一步地，为了获得更高的荧光值和更小的ct值，以进一步提高检测的精确度，所述引物对优选为如seq id no:1和seq id no:2所示的第一引物对。

5、优选地，所述特异性探针的5’端标记有荧光报告基团；

6、和/或，所述特异性探针的3’端标记有荧光猝灭基团。

7、优选地，在具体的实施例中，所述荧光报告基团选自6-fam、hex、tet、cy3、cy5、cy5.5、texas red、yakima yellow和vic中的一种；

8、和/或，所述荧光猝灭基团选自tamra、mgb、bhq-1、bhq-2和bhq-3。

9、优选地，所述荧光报告基团为vic，所述荧光猝灭基团为tamra。

10、本发明还提供了一种用于定量检测副猪嗜血杆菌的荧光pcr检测试剂盒，所述荧光pcr检测试剂盒包括如上所述的荧光pcr引物探针组，以及热启动taq dna聚合酶预混液。

11、优选地，所述热启动taq dna聚合酶预混液至少包括pcr buffer和含有热启动taq酶的酶混合液。这里的pcr buffer和酶混合液可以采用本领域技术人员能够理解和使用的配方进行配制。

12、并且，尤为需要提出的是，在本发明的荧光pcr检测试剂盒中，荧光pcr引物探针组与热启动taq dna聚合酶预混液以全预混的形式存在于试剂盒中。即，在实际检测时，只需要将待测dna模板直接采用具有全预混液（包括荧光pcr引物探针组与热启动taq dna聚合酶预混液）的试剂盒进行荧光pcr反应即可，无需将引物和热启动taq dna聚合酶预混液中的各成分按照次序先后放入。基于此，本技术的这一荧光pcr检测试剂盒大大简化了操作步骤。

13、优选地，在所述荧光pcr检测试剂盒中，所述引物对中每条引物的浓度各自独立地为0.20-0.40μmol/l，所述特异性探针的浓度为0.15-0.25 μmol/l。

14、在实际操作过程中，整个反应过程为：将dna模板加入上述荧光pcr检测试剂盒中即可进行相应的检测。其中，整个反应体系为：dna模板的用量为5μl，荧光pcr引物探针组和热启动taq dna聚合酶预混液的总量为15μl。

15、具体地，荧光pcr引物探针组中，两条引物的浓度各自为10μmol/l，用量各自为0.6μl；特异性探针的浓度为10μmol/l，用量为0.4μl。

16、热启动taqdna聚合酶预混液包括7.5μl的pcr buffer和4.0μl的酶混合液，以及用于补齐余量的ddh2o（1.9μl）。其中，更为具体地，所述pcrbuffer的组分为：0.25m的tris（ph8.6），50mmol/l的kcl，24mmol/l的mgcl2；10mmol/l的dntp，0.25mmol/l的dutp；7%的甘油，2%的甲酰胺，2.5%的dmso，0.05%的np-40，7μg/ml的牛凝血酶，0.5m的脯氨酸，10ng/μl的单链结合蛋白(gp32)，8mmol/l的二硫苏糖醇。所述酶混合液的组分为：2.4u/μl的rna酶抑制剂；0.5u/20μl的尿嘧啶糖基化酶（udg酶）；快速taq酶0.15u/μl。需要说明的是，上述各原料可以在一定范围内进行调节，本发明并不局限于这里的具体的用量。

17、进一步地，基于本技术提出的含有上述成分的全预混液（包括荧光pcr引物探针组和热启动taq dna聚合酶预混液）在本发明的实际扩增过程中，即便采用“一步法”（如前所述，即无需分步加入各组分）实现荧光pcr扩增，其依然具有很好的扩增效果。充分说明了本技术的全预混液操作简便，稳定性好，且扩增灵敏度相较于常规的分步操作没有出现降低。

18、在试剂盒的实际使用过程中，一般热启动taq dna聚合酶预混液的体积一般是阴性质控品和阳性质控品的三倍。例如，一种具体的试剂盒中，酶预混液的规格为825μl/管×1管，阴性质控品的规格为275μl/管×1管，阳性质控品的规格为275μl/管×1管。当然，本发明并不局限于这一配比。

19、本发明还提供了一种以非疾病诊断或治疗为目的的副猪嗜血杆菌的定量检测方法，所述定量检测方法采用如上所述的荧光pcr检测试剂盒。

20、优选地，所述定量检测方法包括：

21、s100、提取待测样本的dna；

22、s200、采用所述荧光pcr检测试剂盒对步骤s100中提取的dna进行荧光扩增；

23、s300、根据荧光扩增结果对待测样本进行判定；且，

24、当ct值≤40时，判断待测样本为副猪嗜血杆菌阳性；

25、当40<ct值≤45时，重复一次实验，若ct值还是在此范围内或小于40，则判断待测样本为副猪嗜血杆菌阳性；若重复实验的ct值大于45，则判断待测样本为副猪嗜血杆菌阴性；

26、当未出现荧光扩增曲线时，判断样品为副猪嗜血杆菌阴性。

27、这里对待测样本的判定，基于阳性对照和空白对照同步进行qpcr检测后的检测结果的对照。其中，一种更为具体的实施例中，这里的阳性对照采用含副猪嗜血杆菌（优选为含有 infb基因片段）的扩增序列质粒，其浓度为105拷贝/μl；阴性对照采用ddh2o。

28、荧光扩增反应的条件为：37℃ 2 min；95℃ 10 s；95℃ 1s、60℃ 20 s，45个循环。从60℃步骤开始收集荧光信号。

29、对待测样本进行判定主要依据其扩增曲线和反应ct值。

30、优选地，所述检测方法还包括：制备阳性对照质粒；将制备的阳性对照质粒按梯度进行稀释后，获得标准样品；对获得的标准样品分别进行荧光扩增后测定ct值，构建形成浓度-ct标准曲线；其中，

31、步骤s300中还包括检测待测样本的ct值，并根据浓度-ct标准曲线，定量检测待测样本的浓度。

32、本发明的实施方式具有如下优点：

33、1、本发明的引物探针组能够特异性检出不同血清型的副猪嗜血杆菌，降低了漏检的可能。

34、2、采用本发明的技术方案，相较于传统的qpcr检测，具有更高的阳性检出率，在检测时间和抗污染方面均有显著的提高。为快速精确地实现副猪嗜血杆菌的检测提供了可靠的技术保证。