一种用于修复缺血/再灌注神经损伤的骨髓间充质干细胞来源的外泌体的提取方法及其应用

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于修复缺血/再灌注神经损伤的骨髓间充质干细胞来源的外泌体的提取方法及其应用。


背景技术：

2.脑卒中发病原因为脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑，包括缺血性和出血性卒中。其中，缺血性卒中较出血性卒中更为常见，缺血性卒中占脑卒中总数60%-70%。目前，治疗缺血性脑卒中的方法主要是溶栓、机械取栓在内的血管再通。但是，这些治疗方法会导致血管再通后血液中氧、糖含量瞬间升高，会破坏缺血时大脑通过侧支循环趋向建立的新平衡，从而引起脑组织的二次损伤，即脑缺血/再灌注损伤。当脑组织处于缺血缺氧的环境，会导致一系列病理事件的发生，如氧化应激，进而导致神经细胞凋亡。因此抑制神经细胞凋亡是缺血性脑卒中神经保护的关键切入点，对脑卒中后期的神经修复也至关重要。因此，寻找、开发能够降低脑缺血/再灌注损伤的药物对治疗缺血性脑卒中来说意义重大。
3.神经星形胶质细胞是大脑内数量最多，分布最广泛的一类细胞，在中枢神经系统中发挥着重要作用，如对神经元细胞起营养支持作用，对大脑组织起保护作用。在缺血性脑卒中中，星形胶质细胞和神经元细胞会快速消耗掉环境中的氧气与养分，将导致神经细胞受到严重损伤，失去存活的能力，从而造成不可逆的神经损伤。在正常生理状态下，健康的神经星形胶质细胞会保护神经元，避免氧化对神经元细胞造成伤害。因此，神经星形胶质细胞可以作为治疗缺血性脑卒中的重要靶点之一。
4.间充质干细胞是一种能自我更新且具备多向分化潜能的成体多能干细胞，在抗凋亡、诱导血管生成等方面发挥着积极作用，同时还具备较强的克隆增殖能力。骨髓间充质干细胞具有分离步骤简单、免疫原性低、对机体损伤小、易于扩增等优点。
5.外泌体是细胞分泌的一种纳米级的特殊小囊泡，在生物学效应上与来源细胞具有一定的相似性，可以穿过血脑屏障，介导着细胞通讯，调控着多种生物学效应，具备稳定性高、灵活穿越组织屏障等优点。目前，骨髓间充质干细胞来源的外泌体作为治疗脑卒中的小分子药物尚未有相关记载。


技术实现要素：

6.针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种能通过抑制神经细胞凋亡来对神经细胞产生保护作用的外泌体药物。
7.本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：本发明提供了一种用于修复缺血/再灌注神经损伤的骨髓间充质干细胞来源的外泌体的提取方法，包括以下步骤：（1）液氮中取出骨髓间充质干细胞冻存管，水浴条件下，迅速摇晃至完全融化，将
骨髓间充质干细胞从冻存管中转移至37℃的（含10%胎牛血清）的完全培养液中，1000 r/min离心5 min；用完全培养液重悬细胞沉淀，将细胞悬液接种在细胞培养皿上，待细胞长至80%-90%，收集细胞培养上清；（2）细胞培养上清高速离心，然后将上清液进行超速离心：，弃去上清，沉淀于预冷的pbs中重悬，再次进行超速离心，沉淀于适当的pbs中重悬即可。
8.进一步的，步骤（1）中，所述水浴的温度为37℃。
9.进一步的，步骤（1）中，所述完全培养液为含10%胎牛血清的dmem/f12。
10.进一步的，步骤（2）中，所述高速离心具体为：300
×
g 4℃离心10 min，2000
×
g 4℃离心15 min，10000
×
g 4℃离心30 min；所述超速离心具体为：上清于4℃下110000
×
g离心90 min。
11.本发明还提供了一种利用上述提取方法提取得到的骨髓间充质干细胞来源的外泌体用于制备修复缺血/再灌注神经损伤、抑制神经细胞凋亡的药物中的应用。
12.本发明将提取的外泌体对氧糖剥夺再灌注的神经星形胶质细胞的存活率进行检测。本发明又进一步对提取的外泌体对氧糖剥夺再灌注的神经星形胶质细胞的凋亡率进行检测。
13.本发明利用透射电镜观察外泌体形态、利用zeta电位及纳米粒度分析仪检测外泌体粒径大小、利用western blot实验检测外泌体标志蛋白来对外泌体进行鉴定。
14.骨髓间充质干细胞来源的外泌体可以改善受损区域微环境，从而改善神经损伤，对神经细胞起保护作用。所以，外泌体也有望成为一种治疗脑卒中的小分子药物。本发明的有益效果为：本发明在于提供骨髓间充质干细胞在抑制神经细胞凋亡方面的应用，研究发现在体外培养体系下，骨髓间充质干细胞来源的外泌体能够显著抑制神经细胞凋亡，从而对神经细胞起到保护作用。因此，本发明验证骨髓间充质干细胞来源的外泌体有望成为治疗脑卒中等神经损伤疾病的一种药物。
附图说明
15.图1为神经星形胶质细胞的鉴定图。
16.图2骨髓间充质干细胞来源外泌体的鉴定图。
17.图3为骨髓间充质干细胞源外泌体对氧糖剥夺再灌注的神经星形胶质细胞存活率影响的结果图。
18.图4为骨髓间充质干细胞源外泌体对氧糖剥夺再灌注的神经星形胶质细胞凋亡率影响的结果图。
具体实施方式
19.以下通过具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述方法思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包含在本发明的范围内。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
20.本发明所使用的培养基dmem/f12购自大连美仑生物技术有限公司。
4℃离心10 min，2000
×
g 4℃离心15 min，10000
×
g 4℃离心30 min，然后进行超速离心：上清于4℃下110000
×
g离心90 min，弃去上清，沉淀于预冷的pbs中重悬，4℃下110000
×
g继续离心90 min，沉淀于适当的pbs中重悬。
42.（2）外泌体的鉴定利用透射电镜观察具体形态，结果如图2所示。
43.利用zeta电位及纳米粒度分析仪来检测粒径大小，结果如图2所示。
44.利用western blot实验来检测外泌体标志蛋白cd63、tsg101以及alix。
45.①
用裂解液裂解外泌体，在冰上孵育15分钟，离心收集上清液。
46.②
采用bca蛋白测定试剂盒测定外泌体蛋白浓度。
47.③
蛋白样品用10% sds-聚丙烯酰胺凝胶分离，将蛋白条带转移到0.45 um pvdf膜上，用5%脱脂奶粉封闭pvdf膜。
48.④
将封闭后的膜与相应的一抗稀释液在4℃孵育过夜，用tbst缓冲液洗涤4次，每次15 min。
49.⑤
将膜与二抗稀释液在4℃孵育4 h，用tbst缓冲液洗涤4次，每次15 min。
50.⑥
用ecl发光液和成像系统观察膜上的蛋白条带。结果如图2所示。
51.实施例3 骨髓间充质干细胞源外泌体抑制氧糖剥夺再灌注的神经星形胶质细胞凋亡利用神经星形胶质细胞，采用氧糖剥夺/复供技术，模拟缺血性脑卒中再灌注。对细胞进行分组：
①
对照组：在饱和湿度、5% co2、37℃培养箱中采用dmem/f12（含10%胎牛血清）的完全培养液培养神经星形胶质细胞。
52.②
模型组(ogd/r)：在5% co2、95%n2三气培养箱中采用dmem/f12（无糖）培养液培养神经星形胶质细胞6 h，然后，将dmem/f12（无糖）培养液更换为dmem/f12（含10%胎牛血清）完全培养液于饱和湿度、5% co2、37℃培养箱中培养神经星形胶质细胞24 h。
53.③
骨髓间充质干细胞源外泌体组(ogd/r+bmscs-exos)：在5% co2、95%n2三气培养箱中采用dmem/f12（无糖）培养液培养神经星形胶质细胞6h，然后，将dmem/f12（无糖）培养液更换为添加了100 ug/ml骨髓间充质干细胞源外泌体的dmem/f12（含10%胎牛血清）完全培养液于饱和湿度、5% co2、37℃培养箱中培养神经星形胶质细胞24 h。
54.（1）cck-8实验将处于对数生长期的神经星形胶质细胞以1
×
105个/ml的密度接种于96孔板，按照对照组、模型组、骨髓间充质干细胞源外泌体组进行处理，每组5个复孔。相应处理后，每孔按照培养液：cck-8溶液=10：1的比例加入cck-8溶液，混匀，饱和湿度、5% co2、37℃培养箱中孵育1.5 h，于450 nm处检测各孔od值。
55.结果如图3所示。结果显示，骨髓间充质干细胞来源外泌体能够显著提高神经细胞存活率。
56.（2）流式细胞技术检测凋亡将处于对数生长期的神经星形胶质细胞以1
×
105个/ml的密度接种于六孔板，按照对照组、模型组、骨髓间充质干细胞源外泌体组进行处理，处理后收集细胞培养液，胰酶消化1min，将收集的细胞培养液重悬消化后的细胞，1000 r/min离心5 min，弃去上清液。
pbs洗涤2次，每次洗涤后1000 r/min离心5 min，弃去上清液。加入500 ul的结合缓冲液，加入5ul annexin v-fitc 轻轻混匀，置入500ul的结合缓冲液，加入5ul annexin v-fitc 轻轻混匀，避光室温反应15 min，加入5 ul pi，在1 h内用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
57.结果如图4所示。结果显示，对照组凋亡率为3.5%，模型组凋亡率为29.44%，骨髓间充质干细胞源外泌体组凋亡率为20.59%，模型组明显诱导细胞凋亡(p《0.05)，骨髓间充质干细胞源外泌体组较模型组凋亡明显减少(p《0.05)。结果表示，骨髓间充质干细胞来源外泌体能够显著降低神经细胞的凋亡率。