一种组织工程级果胶及其制备方法与应用

1.本发明涉及生物制药及组织工程领域，具体涉及一种组织工程级果胶及其制备方法与应用。


背景技术：

2.果胶是一种天然多糖高分子聚合物，分子量在5～30万之间，主链是由d-半乳糖醛酸经α-1,4糖苷键连接而成的长链结构，侧链是由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和木糖等组成的短链结构。果胶在酸性和高温条件下较稳定，在二价阳离子存在时能够形成水凝胶，可用于输送生物活性物质，是一种理想的药物传递系统，并具有控制释放和持续释放的功能。果胶水凝胶因其水分含量高、黏弹性好、扩散传输等特性与细胞外基质相似，可减少环境对组织的刺激，因此可用于制备人造皮肤和其它组织工程产品。以果胶和壳聚糖制备的水凝胶由于具有优良的渗出物吸收能力，是理想的伤口绷带材料。因此果胶作为生物材料在靶向运输药物、组织工程及其它新兴的生物医学应用方面展现出巨大的潜力。
3.目前市场上销售的商品化果胶主要是苹果果胶和柑橘果胶，产品是食品级的，杂质多、纯度低。产品中包括蛋白质、多肽、氨基酸、单糖、多糖、纤维素、半纤维素、挥发油和油脂、有机酸、多酚、内酯、黄酮、维生素、矿物质、内毒素以及色素等杂质，这些杂质进入体内有可能产生不良反应，所以食品级果胶不能直接用于医药和组织工程领域，需要进行纯化，在去除上述杂质后才能应用。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种纯度高、无菌、无内毒的果胶产品，建立操作简单、易于工业化生产的组织工程级果胶制备方法，无需再进行纯化处理就可以作为组织工程产品生产的原料使用。
5.为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
6.一种组织工程级果胶的制备方法，包括如下步骤：
7.(1)食品级果胶加入超纯水中，高速搅拌使果胶完全溶解，果胶溶液浓度为1.0～6.0wt％，优选为1.5～5.0wt％；搅拌转速为500～1500rpm，优选为600～1000rpm；温度为15.0～60.0℃，优选为20.0～50.0℃；搅拌时间1.0～4.0h，优选为1.5～3.0h。
8.(2)滴加1.0m的naoh溶液调果胶溶液ph至7.0～8.0，然后进行微滤膜过滤，微滤膜孔径为0.8、0.45和0.22μm，去除不溶性杂质，过滤温度为15.0～60.0℃，优选为20.0～50.0℃。
9.(3)果胶溶液无菌过滤，微滤膜孔径为0.22μm；过滤温度为15.0～60.0℃，20.0～50.0℃。
10.(4)在无菌环境中(b级背景下的a级)将果胶加入到带有搅拌装置的反应器内，并在高速搅拌条件下将1.0m的hcl溶液缓慢加入到果胶溶液中调节ph至1.5～3.0，果胶溶液形成水凝胶，高速搅拌将水凝胶打成细小的颗粒，持续搅拌使凝胶中的内毒素、水溶性蛋白
及水溶性色素等杂质溶出；搅拌时间为1.0～4.0h，优选为1.5～3.0h；温度为室温。
11.(5)过滤去除水溶液，收获滤饼加入1.0m的naoh溶液溶解水凝胶得果胶溶液，调节溶液ph至7.0～8.0，温度为室温。
12.(6)加入无菌、无内毒素的超纯水稀释果胶溶液至浓度为1.0～6.0wt％，优选为1.5～5.0wt％；重复1～4次上述步骤(4)和(5)，直至完全去除水溶性的杂质。
13.(7)果胶溶液加入到带有搅拌装置的反应器内，在高速搅拌条件下缓慢加入无水乙醇，使果胶溶液形成凝胶，高速搅拌将凝胶打成细小的颗粒，持续搅拌使凝胶中残留的内毒素、脂溶性蛋白及脂溶性色素等杂质溶出，乙醇的质量分数为75.0wt％；温度为2.0～30.0℃，优选为4.0～25.0℃；搅拌时间为1.0～4.0h，优选为1.5～3.0h。
14.(8)过滤去除水溶液，收获滤饼并加入无菌、无内毒素的超纯水溶解，果胶溶液浓度为4.0～15.0wt％，优选为6.0～12.0wt％，重复1～4次上述步骤(7)和(8)，直至完全去除脂溶性杂质。
15.(9)过滤得到的滤饼于-80℃冰箱中冷冻，再进行冷冻干燥，得到白色絮状产品。
16.一种组织工程级果胶，按上述制备方法制备而成。
17.进一步的，上述组织工程级果胶，蛋白质杂质含量＜0.5mg/g；
18.进一步的，上述组织工程级果胶，色素等杂质去除率＞99.0％；
19.进一步的，上述组织工程级果胶，内毒素含量＜50.0eu/g；
20.本发明还提供了上述组织工程级果胶在用于制备微囊化细胞移植治疗的制剂以及其它组织工程领域的应用。
21.与现有技术相比，本发明的优点在于：
22.(1)本发明利用果胶能够形成酸凝胶的特性，以无菌、无内毒素的超纯水洗脱，使水溶性杂质及内毒素从凝胶中溶出，并且利用果胶能够形成醇凝胶的特性，以75％的乙醇溶液洗脱，使脂溶性杂质从凝胶中溶出，从而达到纯化的目的。
23.(2)本发明纯化果胶所用的化学试剂以及辅助材料较少，只有hcl、naoh和乙醇，hcl和naoh可以中和形成nacl，无毒性并且可以随水分去除，而乙醇毒性较小且挥发性良好，不会在产品中残留，所以纯化过程不会引入杂质。
24.(3)本发明纯化果胶所用的化学试剂和辅助材料只有hcl、naoh和乙醇，hcl和naoh可以中和形成nacl，而乙醇可以蒸馏回收，所以产生的废水很少，是环境友好的绿色生产工艺。
25.(4)本发明纯化工艺操作简单，易于工艺放大和工业化生产。
具体实施方式
26.为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种组织工程级果胶及其制备方法与应用进行说明，以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但本发明的保护范围不受以下实施例的限制。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。
27.实施例1
28.一种组织工程级果胶制备方法如下：
29.(1)食品级果胶加入超纯水中，高速搅拌使果胶完全溶解，果胶溶液浓度为
4.0wt％，搅拌转速为1000rpm，温度为25.0℃，搅拌时间2.0h；
30.(2)滴加1.0m的naoh溶液调果胶溶液ph至8.0，然后进行微滤膜过滤，微滤膜孔径为0.8、0.45和0.22μm，去除不溶性杂质，过滤温度为25.0℃；
31.(3)0.22μm微滤膜进行无菌过滤，得到无菌溶液，过滤温度为50.0℃；
32.(4)在无菌环境中(b级背景下的a级)将果胶加入到带有搅拌装置的反应器内，并在高速搅拌条件下将1.0m的hcl溶液缓慢加入到果胶溶液中调节ph至2.0，果胶溶液形成水凝胶，高速搅拌将水凝胶打成细小的颗粒，持续搅拌使凝胶中的内毒素、水溶性蛋白及水溶性色素等杂质溶出，搅拌时间为2.0h，温度为室温；
33.(5)过滤去除水溶液，收获滤饼加入1.0m的naoh溶液溶解凝胶得果胶溶液，调节溶液ph至8.0，温度为室温；
34.(6)加入无菌、无内毒素的超纯水稀释果胶溶液至浓度为4.0wt％，；重复3次上述步骤(4)和(5)，直至完全去除水溶性的杂质；
35.(7)果胶溶液加入到带有搅拌装置的反应器内，在高速搅拌条件下缓慢加入无水乙醇，使果胶溶液形成凝胶，高速搅拌将凝胶打成细小的颗粒，持续搅拌使凝胶中残留的内毒素、脂溶性蛋白及脂溶性色素等杂质溶出，乙醇的质量分数为75.0wt％，温度为10.0℃；
36.(8)过滤去除水溶液，收获滤饼并加入无菌、无内毒素的纯化水溶解，果胶溶液浓度为10.0wt％，重复2次上述步骤(7)和(8)，直至完全去除脂溶性杂质；(9)过滤得到的滤饼于-80℃冰箱中冷冻，再进行冷冻干燥，得到白色絮状产品。
37.对比例1
38.一种组织工程级果胶制备方法如下：
39.同实施例1
40.制备条件改为酸凝胶洗脱次数为3次，醇凝胶洗脱次数为1次。
41.对比例2
42.一种组织工程级果胶制备方法如下：
43.同实施例1
44.制备条件改为酸凝胶洗脱次数为3次。
45.对比例3
46.一种组织工程级果胶制备方法如下：
47.同实施例1
48.制备条件改为醇凝胶洗脱次数为2次。
49.实施例2
50.一种组织工程级果胶制备方法如下：
51.同实施例1
52.制备条件改为酸凝胶洗脱次数为4次，醇凝胶洗脱次数为4次。
53.对比例4
54.一种组织工程级果胶制备方法如下：
55.同实施例1
56.制备条件改为酸凝胶洗脱次数为4次，醇凝胶洗脱次数为1次。
57.对比例5
58.一种组织工程级果胶制备方法如下：
59.同实施例1
60.制备条件改为酸凝胶洗脱次数为4次。
61.实施例3
62.一种组织工程级果胶制备方法如下：
63.同实施例1
64.制备条件改为酸凝胶洗脱次数为2次，醇凝胶洗脱次数为2次。
65.对比例6
66.一种组织工程级果胶制备方法如下：
67.同实施例1
68.制备条件改为酸凝胶洗脱次数为2次，醇凝胶洗脱次数为1次。
69.对比例7
70.一种组织工程级果胶制备方法如下：
71.同实施例1
72.制备条件改为酸凝胶洗脱次数为2次，醇凝胶洗脱次数为1次。
73.对比例8
74.一种组织工程级果胶制备方法如下：
75.同实施例1
76.制备条件改为酸凝胶洗脱次数为2次，醇凝胶洗脱次数为3次。
77.对比例9
78.一种组织工程级果胶制备方法如下：
79.同实施例1
80.制备条件改为酸凝胶洗脱次数为2次，醇凝胶洗脱次数为4次。
81.实施例4制备样本杂质含量检测
82.1、检测方法
83.(1)色素等杂质检测方法
84.果胶溶液中加入0.1m的氯化钙溶液使果胶形成钙凝胶，高速搅拌将凝胶打成细小的颗粒，抽滤将凝胶与水溶液分离，收集滤液，凝胶依次用0.1m的盐酸溶液和0.1m的氢氧化钠溶液清洗，抽滤并收集滤液；将上述收集到的滤液合并，减压蒸馏浓缩滤液获得含杂质浓度较高的溶液；将该溶液在300-600波长范围内进行扫描，确定果胶杂质最大吸收波长，测试结果显示果胶杂质在326nm处有最大吸收，所以确定以326nm出的吸光度变化考察果胶溶液除杂效果。
[0085][0086]
其中：溶液的吸光度均在果胶杂质最大吸收波长326nm处测定。
[0087]
(2)蛋白质含量测定
[0088]
果胶中蛋白质含量采用bca蛋白浓度测定试剂盒法测定，检测步骤如下：
[0089]
1)取1ml蛋白标准配制液加入到蛋白标准液中，充分溶解后配制成20mg/ml的蛋白标准溶液，配制后可立即使用，溶解后的蛋白标准溶液应-20℃保存。
[0090]
2)取适量20mg/ml的蛋白标准溶液，稀释至终浓度为500μg/ml。
[0091]
3)根据样品数量，按试剂(a)：试剂(b)＝50:1的比例配制bca工作液。其中试剂(a)主要由bca、碳酸氢钠等组成，试剂(b)主要由硫酸铜等组成。
[0092]
4)将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板的标准品孔中，加稀释液补足到20μl。
[0093]
5)各孔加入200μl配制好的bca工作液，37℃放置20～30min。
[0094]
6)测定562nm波长的吸光值。
[0095]
7)以蛋白标准液浓度为横坐标，以od
562
值为纵坐标做标准曲线，得线性相关方程。
[0096]
8)将检测果胶样品20μl加到96孔板的标准品孔中。
[0097]
9)各孔加入200μl配制好的bca工作液，37℃放置20～30min。
[0098]
10)测定562nm波长的吸光值。
[0099]
11)根据标准曲线计算出样品蛋白浓度。
[0100]
(3)内毒素含量测定
[0101]
内毒素含量采用天大天发的bet-72型内毒素测定仪测定，测定步骤如下：
[0102]
1)标准曲线制作：
[0103]
a.标准品系列浓度溶液准备：将细菌内毒素标准品用细菌内毒素检查用水按5倍比例稀释，制备成包含5个标准浓度的标准系列溶液，浓度为25、5、1、0.2、0.04eu/ml，每个标准浓度在测定时最少要做三个平行管，稀释步骤参照凝胶法标准品稀释步骤。
[0104]
b.溶解分装鲎试剂：根据用量溶解鲎试剂，分装到无热源的仪器专用检测管内，每支检测管内0.1ml(要求没有气泡)。
[0105]
c.加样：取稀释好的内毒素系列浓度溶液，根据所设定管数分别加入有鲎试剂的小试管中0.1ml，注意加样前应混合溶液30s，且每个浓度点加样前应更换加样头。另取细菌内毒素检查用水做阴性对照。
[0106]
d.检测：每个浓度点在加完样后应立即封口膜封口，放入细菌内毒素测定仪设定位置，仪器自动开始检测。待标准曲线最后一个浓度的od值超过预设值后，用鼠标点击【手动停止检测】，停止数据采集。点击标准曲线坐标画面，生成并储存标准曲线，计算出相关系数。
[0107]
2)样品检测
[0108]
根据用量溶解鲎试剂，分装到无热源的专用检测管内，每只检测管内0.1ml(要求没有气泡)。取稀释好的供试品系列浓度溶液、供试品阳性系列溶液、阳性标准品溶液，根据所设定平行管数分别加入有鲎试剂的小试管中0.2ml(没有气泡)，注意加样前应混合溶液30s，且每个浓度点加样前应更换加样头。另取细菌内毒素检查用水做阴性对照，每个浓度点在加完样后应立即用封口膜封口，放入分析仪设定位置，仪器自动开始检测。试验完成后，用鼠标点击【手动停止检测】，停止数据采集。在【标准曲线】处选择标准曲线后，计算机自动计算出结果。
[0109]
2、检测结果
[0110][0111][0112]
从实验结果分析，酸凝胶洗脱主要是去除蛋白质和内毒素，如果洗脱3次，无论是否采取醇凝胶洗脱，最终产品蛋白质和和内毒素含量都能达到较低的水平；如洗脱4次，虽然蛋白质和内毒素含量都有所下降，但是与洗脱3次相比下降幅度不大；而洗脱2次蛋白质与内毒素含量都较洗脱3次高很多，即使增加醇凝胶洗脱次数也不能使蛋白质和内毒素含量降到较低的水平；当然酸凝胶洗脱也能去除一部分水溶性杂质。醇凝胶主要去除色素等杂质，醇凝胶洗脱次就能够去除大部分的色素等杂质，但是单纯的醇凝胶不能完全去除色素等杂质，而是与酸凝胶洗脱配合才能达到较好的去除效果。从上述实验结果看，3次酸凝胶洗脱外加2次醇凝胶洗脱，得到的果胶产品色素等杂质、蛋白杂质及内毒素都能够很好的去除，从而得到组织工程级果胶，可以在组织工程领域应用。
[0113]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。