一种基于麻疹病毒载体包装病毒样颗粒冠状病毒疫苗的方法

本发明属于生物医药，涉及一种基于麻疹病毒载体包装病毒样颗粒冠状病毒疫苗的方法，具体涉及一种以麻疹病毒为载体包装呈递携带冠状病毒rbd的重组基孔肯雅病毒样颗粒vlp-df33的方法。

背景技术：

1、冠状病毒是一种有囊膜的正义rna病毒，属于冠状病毒科冠状病毒属。一些冠状病毒严重威胁人类健康，如导致严重呼吸综合征(sars)爆发的sars-cov和导致中东呼吸综合征(mers)爆发的mers-cov，以及导致新型冠状病毒感染(covid-19)的sars-cov-2。抵御病毒感染最有效的方式就是疫苗接种。

2、申请人在先发明“一种基于病毒样颗粒呈递冠状病毒受体结合区的冠状病毒亚单位疫苗”(中国专利申请202110647651.x，申请日2021年6月10日)，依据重组基孔肯雅病毒样颗粒表面呈递sars-cov-2的rbd蛋白制备得到的重组病毒样颗粒(命名为vlp-df33)是一种比较好的免疫抗原，该专利申请中的实验数据证明所得重组病毒样颗粒表面高密度展示sars-cov-2rbd以刺激免疫细胞产生针对rbd的免疫反应及抗体。对balb/c小鼠进行免疫，发现其能够高效刺激小鼠产生针对sars-cov-2 rbd的抗体，并能够诱导产生高滴度的中和抗体。但是目前尚未开发出合适的生产工艺。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种基于麻疹病毒载体包装的病毒样颗粒疫苗。

2、第一方面，本发明要求保护一种重组麻疹病毒。

3、本发明所要求保护的重组麻疹病毒为在麻疹病毒的p基因和m基因之间插入编码携带冠状病毒rbd的重组基孔肯雅病毒样颗粒vlp-df33的核苷酸序列后所得。

4、进一步地，所述重组麻疹病毒的基因组为单股负链rna，其核苷酸序列如seq idno.13所示。

5、所述重组麻疹病毒的病毒颗粒可由麻疹病毒的n蛋白、麻疹病毒的p蛋白、所述重组基孔肯雅病毒样颗粒vlp-df33、麻疹病毒的m蛋白、麻疹病毒的f蛋白、麻疹病毒的h蛋白和麻疹病毒的l蛋白和所述重组麻疹病毒基因组自组装构形成。

6、第二方面，本发明要求保护一种递送携带冠状病毒rbd的重组基孔肯雅病毒样颗粒vlp-df33的方法(或利用麻疹病毒生产携带冠状病毒rbd的重组基孔肯雅病毒样颗粒vlp-df33的方法)。

7、本发明要求保护的递送携带冠状病毒rbd的重组基孔肯雅病毒样颗粒vlp-df33的方法，是以麻疹病毒为载体递送携带冠状病毒rbd的重组基孔肯雅病毒样颗粒vlp-df33。

8、进一步地，本发明要求保护的递送携带冠状病毒rbd的重组基孔肯雅病毒样颗粒vlp-df33的方法可包括如下步骤：将前文第一方面中所述的重组麻疹病毒感染宿主或宿主细胞，在所述重组麻疹病毒的传代扩增过程中产生并释放所述重组基孔肯雅病毒样颗粒vlp-df33，从而完成向所述宿主或所述宿主细胞递送所述重组基孔肯雅病毒样颗粒vlp-df33。

9、本发明要求保护的利用麻疹病毒生产携带冠状病毒rbd的重组基孔肯雅病毒样颗粒vlp-df33的方法可包括如下步骤：将前文第一方面中所述的重组麻疹病毒感染宿主或宿主细胞，在所述重组麻疹病毒的传代扩增过程中产生并释放所述重组基孔肯雅病毒样颗粒vlp-df33。

10、第三方面，本发明要求保护如下任一生物材料：

11、(a1)重组核酸分子，所述重组核酸分子由编码所述重组基孔肯雅病毒样颗粒vlp-df33的多核苷酸连接到特定cdna分子的特定位置处后所得；

12、所述特定cdna分子编码麻疹病毒(mv)的全长感染性正义rna链，自n端到c端依次编码麻疹病毒的核(n)蛋白、磷酸化(p)蛋白、膜(m)蛋白、融合(f)蛋白、血凝素(h)蛋白和聚合酶(l)蛋白；

13、所述特定位置为所述特定cdna分子中编码p蛋白的多核苷酸和编码m白的多核苷酸之间；

14、(a2)含有(a1)中所述重组核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌；

15、进一步地，所述表达盒是从5’到3’包含以下多核苷酸的dna：

16、(a)t7启动子；

17、(b)编码锤头状核酶(hammerhead ribozyme)的多核苷酸；

18、(c)麻疹病毒(mv)基因组3’端非编码区3’nct；

19、(d)编码麻疹病毒(mv)的n蛋白的多核苷酸；

20、(e)编码麻疹病毒(mv)的p蛋白的多核苷酸；

21、(f)编码携带冠状病毒rbd的重组基孔肯雅病毒样颗粒vlp-df33的多核苷酸；

22、(g)编码麻疹病毒(mv)的m蛋白的多核苷酸；

23、(h)编码麻疹病毒(mv)的f蛋白的多核苷酸；

24、(i)编码麻疹病毒(mv)的h蛋白的多核苷酸；

25、(j)编码麻疹病毒(mv)的l蛋白的多核苷酸；

26、(k)麻疹病毒(mv)基因组5’端非编码区5’nct；

27、(l)编码hdv核酶(hdv ribozyme)的多核苷酸；

28、(m)t7终止子；

29、从3’ntc到5’ntc的核苷酸数量严格控制在六的倍数。

30、更进一步地，所述表达盒的全序列如seq id no.1所示；

31、(a3)重组质粒1，为将携带有seq id no.1所示dna片段的重组质粒；

32、在本发明的具体实施方式中，所述重组质粒1为将seq id no.1所示dna片段插入到pet22b质粒上后得到的重组质粒，命名为bv4。

33、(a4)重组质粒2，包括编码麻疹病毒(mv)的l蛋白的核酸分子；

34、在本发明的具体实施方式中，所述重组质粒2为将所述核酸分子克隆到pcmv载体上后形成的重组质粒，命名为pcmv-l，其全序列如seq id no.2所示。

35、(a5)重组质粒3，为用于慢病毒包装的重组质粒，包括编码麻疹病毒(mv)的n蛋白和t7 rna聚合酶的核酸分子；

36、在本发明的具体实施方式中，所述重组质粒3为将所述核酸分子克隆到plvx-ef1α-ires-puro载体后形成的重组质粒，命名为plvx-n-t7-puro，其全序列如seq id no.3所示。

37、(a6)重组质粒4，为用于慢病毒包装的重组质粒，包括编码麻疹病毒(mv)的p蛋白的核酸分子；

38、在本发明的具体实施方式中，所述重组质粒4为将所述核酸分子克隆到plvx-ires-bsd载体后形成的重组质粒，命名为plvx-p-bsd，其全序列如seq id no.4所示。

39、(a7)稳定细胞系st293t，为能稳定表达麻疹病毒(mv)的n蛋白、p蛋白和t7 rna聚合酶的hek 293t细胞系；

40、进一步地，所述稳定细胞系st293t按照包括如下步骤的方法获得：将(a5)中所述重组质粒3和(a6)中所述重组质粒4与辅助质粒pspax2,pmd2.g共同转染hek 293t细胞，包装出重组慢病毒，然后将所述重组慢病毒感染hek 293t细胞，通过抗性筛选获得所述稳定细胞系st293t；

41、(a8)由(a3)中所述重组质粒1、(a4)中所述重组质粒2、(a5)中所述重组质粒3和(a6)中所述重组质粒4组成的成套重组质粒；

42、(a9)由(a3)中所述重组质粒1、(a4)中所述重组质粒2和(a7)中所述稳定细胞系st293t组成的成套产品1；

43、(a10)由(a9)中所述成套产品1和宿主细胞组成的成套产品2。

44、第四方面，本发明要求保护一种制备前文第一方面所述重组麻疹病病毒的方法。

45、本发明要求保护的制备前文第一方面所述重组麻疹病病毒的方法，可包括如下步骤：将前文第三方面(a3)中所述的重组质粒1和(a4)中所述的重组质粒2导入(a7)中所述的稳定细胞系st293t，然后与宿主细胞进行共培养，进而获得所述重组麻疹病病毒。

46、在上述各方面中，所述重组基孔肯雅病毒样颗粒vlp-df33为由基孔肯雅病毒的capsid蛋白、基孔肯雅病毒的e1蛋白、融合蛋白a和基孔肯雅病毒的6k蛋白自组装形成的；所述融合蛋白a含有基孔肯雅病毒的e2蛋白、e3蛋白和特异蛋白；所述特异蛋白为冠状病毒受体结合域片段(如sars-cov-2s蛋白的rbd区段)。

47、进一步地，所述特异蛋白替换基孔肯雅病毒的e3蛋白与e2蛋白之间的furin酶切位点。

48、进一步地，所述融合蛋白a中还可含有用于纯化的标签蛋白，如flag标签。

49、更进一步地，所述融合蛋白a自n端到c端依次包括基孔肯雅病毒的e3蛋白、所述特异蛋白、基孔肯雅病毒的e2蛋白的n端区段、flag标签和基孔肯雅病毒的e2蛋白的c端区段。

50、其中，所述flag标签插入到基孔肯雅病毒的e2蛋白的第204位和第205位氨基酸之间。

51、在本发明的具体实施方式中，所述融合蛋白a自n端到c端依次由基孔肯雅病毒的e3蛋白、柔性肽1、所述特异蛋白、柔性肽2、基孔肯雅病毒的e2蛋白的n端区段、柔性肽3、flag标签、柔性肽4和基孔肯雅病毒的e2蛋白的c端区段组成。

52、其中，用于连接功能蛋白或蛋白功能区的四个柔性肽可根据实际情况设置，包括：若某一个或多个柔性肽前后的功能蛋白或蛋白功能区直接相连不会影响相关蛋白的功能，则可以省去相应柔性肽而采用直接连接法。当然，也可以采用多种柔性肽，如gsgg、gggs、sgs、sssg、ggggs、(ggggs)n等，只要不影响相关蛋白的功能即可。

53、在上述各方面中，所述宿主可为能够被麻疹病毒感染的动物或人。

54、在上述各方面中，所述宿主细胞可为能够被麻疹病毒感染的动物源细胞或人源细胞。

55、在本发明的具体实施方式中，所述宿主细胞为vero细胞。

56、第五方面，本发明要求保护如下任一应用：

57、(b1)前文第三方面所述生物材料在制备前文第一方面所述重组麻疹病毒中的应用；

58、(b2)前文第一方面所述的重组麻疹病毒或前文第三方面所述生物材料在制备用于预防和/或治疗冠状病毒(如sars-cov-2)感染所致疾病的产品(如疫苗或药物)中的应用；

59、(b3)前文第一方面所述的重组麻疹病毒或前文第三方面所述生物材料在制备用于缓解冠状病毒(如sars-cov-2)感染所致症状的产品(如疫苗或药物)中的应用。

60、在上述各方面中，所述麻疹病毒的n蛋白的氨基酸序列如seq id no.5所示；或者与seq id no.具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；或者将seq id no.经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

61、在上述各方面中，所述麻疹病毒的p蛋白的氨基酸序列如seq id no.6所示；或者与seq id no.6具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；或者将seq id no.6经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

62、在上述各方面中，所述麻疹病毒的m蛋白的氨基酸序列如seq id no.7所示；或者与seq id no.7具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；或者将seq id no.7经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

63、在上述各方面中，所述麻疹病毒的f蛋白的氨基酸序列如seq id no.8所示；或者与seq id no.8具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；或者将seq id no.8经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

64、在上述各方面中，所述麻疹病毒的h蛋白的氨基酸序列如seq id no.9所示；或者与seq id no.9具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；或者将seq id no.9经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

65、在上述各方面中，所述麻疹病毒的l蛋白的氨基酸序列如seq id no.10所示；或者与seq id no.10具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；或者将seq id no.10经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

66、在上述各方面中，所述t7 rna聚合酶的氨基酸序列如seq id no.11所示；或者与seq id no.11具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；或者将seq id no.111经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

67、在上述各方面中，重组基孔肯雅病毒样颗粒vlp-df33的氨基酸序列可如seq idno.12所示；或者与seq id no.12具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；或者将seq id no.12经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

68、其中，所述冠状病毒受体结合域片段(sars-cov-2s蛋白的rbd区段)的氨基酸序列可如seq id no.12的第325-518位所示；或者，来源于冠状病毒(sars-cov-2)且与seq idno.12的第325-518位所示的蛋白质具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；或者将seq id no.12的第325-518位所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

69、所述基孔肯雅病毒的capsid蛋白的氨基酸序列可如seq id no.12的第11-274位所示；或者来源于基孔肯雅病毒且与seq id no.12的第11-274位所示的蛋白质具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；或者将seq id no.12的第11-274位所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。所述基孔肯雅病毒的e1蛋白的氨基酸序列可如seq id no.12的第1032-1460位所示；或者来源于基孔肯雅病毒且与seq id no.12的第1032-1460位所示的蛋白质具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；或者将seq id no.12的第1032-1460位所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。所述基孔肯雅病毒的6k蛋白的氨基酸序列可如seq id no.12的第971-1031位所示；或者来源于基孔肯雅病毒且与seq id no.12的第971-1031位所示的蛋白质具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；或者将seq id no.12的第971-1031位所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。所述基孔肯雅病毒的e3蛋白的氨基酸序列可如seq id no.12的第275-321位所示；或者来源于基孔肯雅病毒且与seq idno.12的第275-321位所示的蛋白质具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；或者将seq id no.12的第275-321位所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

70、所述flag标签的氨基酸序列可如seq id no.12的第730-737位所示。所述基孔肯雅病毒的e2蛋白的n端区段的氨基酸序列可如seq id no.12的第523-726位所示；或者来源于基孔肯雅病毒且与seq id no.12的第523-726位所示的蛋白质具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；或者将seq id no.12的第523-726位所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。所述基孔肯雅病毒的e2蛋白的c端区段的氨基酸序列可如seq id no.12的第742-970位所示；或者来源于基孔肯雅病毒且与seq id no.12的第742-970位所示的蛋白质具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；或者将seq id no.12的第742-970位所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

71、在相关方面中，所述表达盒中，所述t7启动子的序列如seq id no.1的第1-19位所示。

72、在相关方面中，所述表达盒中，所述锤头状核酶(hammerhead ribozyme)编码序列如seq id no.1的第39-93位所示。

73、在相关方面中，所述表达盒中，所述3’nct的序列如seq id no.1的第94-200位所示。

74、在相关方面中，所述核酸分子中，编码所述麻疹病毒的n蛋白的核酸分子如seq idno.1的第201-1778位所示；或者为seq id no.3的第3535-5118位所示；或者与seq id no.1的第201-1778位或seq id no.3的第3535-5118位具有98％以上同一性且编码所述麻疹病毒的n蛋白的dna分子。

75、在相关方面中，所述核酸分子中，编码所述麻疹病毒的p蛋白的核酸分子如seq idno.1的第1900-3423位所示；或者为seq id no.4的第2817-4343位所示；或者与seq idno.1的第1900-3423位或seq id no.4的第2817-4343位具有98％以上同一性且编码所述麻疹病毒的p蛋白的dna分子。

76、在相关方面中，所述核酸分子中，编码所述麻疹病毒的m蛋白的核酸分子如seq idno.1的第8049-9056位所示；或者与seq id no.1的第8049-9056位具有98％以上同一性且编码所述麻疹病毒的m蛋白的dna分子。

77、在相关方面中，所述核酸分子中，编码所述麻疹病毒的f蛋白的核酸分子如seq idno.1的第10069-11721位所示；或者与seq id no.1的第10069-11721位具有98％以上同一性且编码所述麻疹病毒的f蛋白的dna分子。

78、在相关方面中，所述核酸分子中，编码所述麻疹病毒的h蛋白的核酸分子如seq idno.1的第11882-13735位所示；或者与seq id no.1的第11882-13735位具有98％以上同一性且编码所述麻疹病毒的h蛋白的dna分子。

79、在相关方面中，所述核酸分子中，编码所述麻疹病毒的l蛋白的核酸分子如seq idno.1的第13845-20396位所示；或者为seq id no.2的第3471-10031位所示；或者与seq idno.1的第13845-20396位或seq id no.2的第3471-10031位具有98％以上同一性且编码所述麻疹病毒的l蛋白的dna分子。

80、在相关方面中，所述核酸分子中，编码所述重组基孔肯雅病毒样颗粒vlp-df33的核酸分子如seq id no.1的第3570-7952位所示；或者与seq id no.1的第3570-7952位具有98％以上同一性且编码所述重组基孔肯雅病毒样颗粒vlp-df33的dna分子。

81、在相关方面中，所述表达盒中，所述5’nct的序列如seq id no.1的第20397-20505位所示。

82、在相关方面中，所述表达盒中，所述hdv核酶(hdv ribozyme)编码序列如seq idno.1的第20506-20550位所示。

83、在相关方面中，所述表达盒中，所述t7终止子的序列如seq id no.1的第20659-20706位所示。

84、在相关方面中，所述核酸分子中，编码t7聚合酶的多核苷酸序列为seq id no.3的第5748-8399位所示。

85、实验证明，本发明选用麻疹病毒作为载体可以成功包装扩增重组病毒样颗粒vlp-df33。重组病毒样颗粒vlp-df33可以用于免疫，刺激免疫系统产生抗体预防冠状病毒感染。并且，本发明利用麻疹病毒载体递送编码抗原vlp-df33的基因到机体细胞，而后由机体细胞生产vlp-df33抗原，从而不需要开发工艺进行vlp-df33抗原的生产，而只需要利用现有非常成熟的麻疹病毒疫苗生产工艺生产重组麻疹病毒。再有，基于麻疹病毒载体的疫苗可以通过注射接种，也可以通过喷雾剂的形式接种，有便于疫苗的接种。另外，由于麻疹病毒减毒活疫苗的生产和应用在世界范围都很广泛，基于这一技术平台开发的候选疫苗更容易在世界各地进行生产。