一株亚硝酸盐积累型反硝化无色杆菌及其应用

本发明属于工业微生物技术和环境微生物，具体涉及一株亚硝酸盐积累型反硝化无色杆菌及其应用，该异养反硝化无色杆菌菌株能够还原硝酸盐氮、积累亚硝酸盐氮，可用于废水脱氮和防控硫酸盐还原菌引发危害等领域。

背景技术：

1、废水中的氮通常以有机氮、氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮四种形态存在。生物法和化学法是废水脱氮的主要方法。化学法通常只能去除氨氮，处理费用高，并且可能产生二次污染。生物法不但能通过硝化和反硝化作用将污水中的氮转化为氮气从污水中去除，还能去除废水中的有机物，是污水脱氮处理的主流工艺。传统生物脱氮途径一般包括氨化、硝化和反硝化阶段。在厌氧环境下，微生物通过氨化作用将有机氮转化为氨氮；在好氧环境下，硝化菌通过硝化作用把氨氮转化为硝酸盐氮；随后在缺氧环境下，反硝化菌通过反硝化作用把硝酸盐氮转化为氮气。与上述传统生物脱氮相比，厌氧氨氧化是一种新型生物脱氮工艺，脱氮效率高，能够大幅度节约能耗，减少污泥产量，具有良好的应用价值，是废水脱氮领域的研究热点。厌氧氨氧化以硝酸盐氮为电子受体、以氨为电子供体，进行硝酸盐氮还原反应或将亚硝酸盐氮转化为氮气。实现厌氧氨氧化的前提是获得稳定的亚硝酸盐氮作为电子受体。目前，部分亚硝化和部分反硝化是实现亚硝酸盐氮积累的主要途径。现有技术很难实现稳定的部分亚硝化，且部分亚硝化与厌氧氨氧化联用技术处理的污水中含有大量硝酸盐氮。部分反硝化与厌氧氨氧化技术联用可以同步脱氮除有机物，解决出水中硝酸盐积累的问题，具有操作简单、运行稳定等优点，表现出巨大的应用前景。

2、硝酸盐还原菌及其代谢中间产物还能有效抑制硫酸盐还原菌的生长代谢，可用于防控油藏酸化和管道防腐领域。硫酸盐还原菌广泛存在于缺氧的自然环境中。其代谢产生的h2s是一种酸性、易燃、具有臭味的有毒气体。在油田生产过程中，srb及其代谢产生的h2s可导致油藏酸化以及注水管网、抽油装置、集输管道等腐蚀穿孔，严重危害着油田的生产安全和经济效益。向油藏储层中注入硝酸盐可以激活地下硝酸盐还原菌，实现对硫酸盐还原菌生长代谢的抑制：nrb在与srb竞争中占据优势，能够优先利用油藏中有限的有机物作为电子供体，对硫酸盐还原菌生长代谢具有明显抑制作用；硝酸盐还原菌代谢产生的中间物质no2-是异化亚硫酸盐还原酶的竞争性抑制剂，对硫酸盐还原菌代谢产h2s具有抑制作用。

3、基于以上应用和技术需求，本专利提供一株反硝化无色杆菌（ achromobacter  denitrificans）pj5，该菌株能够将硝酸盐氮还原为亚硝酸盐氮，实现亚硝酸盐氮的稳定积累。该菌株可以与厌氧氨氧化技术联用，实现污水同步脱氮除有机物。此外，该菌株对硫酸盐还原菌及其代谢产h2s的抑制作用使其在防控油藏酸化和管道防腐领域具有巨大的应用价值。

技术实现思路

1、为了实现厌氧氨氧化技术中稳定的亚硝酸氮积累、同步脱除污水中的氮和有机物、解决出水中硝酸盐积累、防控油藏酸化和管道腐蚀等问题，本发明提供一种积累亚硝酸盐氮的异养反硝化菌及其制备方法与用途。

2、一株能够还原硝酸盐氮、积累亚硝酸盐氮的异养型反硝化菌，具体为反硝化无色杆菌 achromobacter denitrificans pj5。

3、所述菌株已于2022年09月07日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.25657，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

4、所述菌株革兰氏染色为阴性、杆状、无芽孢，菌落为单个凸起菌落、边缘规则、乳黄色。

5、所述菌株含有膜结合硝酸还原酶和氧化亚氮还原酶的编码基因，能够将no3-n转化为no2-n实现亚硝酸盐氮的积累，同时能够将环境中的n2o转化为n2，减少温室气体的排放。

6、本发明还提供了一种含有上述微生物菌株培养液、菌悬液或含有其的菌剂的制备方法。种子液制备：将菌株pj5从零下80℃保存的甘油管中取出，通过划线培养的方式接种于含有无菌固体lb培养基的培养皿中于16-45℃培养箱中培养至长出单菌落。用接种针挑取单菌落接种于含有5ml无菌液体lb培养基的试管中，16-45℃震荡培养12-36h，此时获得种子液，菌浓达到109-1010个/ml培养液。培养液制备方法一：将上述种子液按照1-5%接种量接种于无菌lb液体培养基中于16-45℃培养时间12-36h，溶氧量控制在100％的空气饱和度。培养液制备方法二：将上述种子液按照1-5%接种量接种于含磷酸氢二钠0-2 g/l、磷酸二氢钾0-2 g/l、硝酸钠0-5 g/l、硫酸亚铁0-1 g/l、六水合硫酸镁0-1 g/l、氯化钙0.01 g/l、酵母浸粉0.01 g/l，糖蜜0-5 g/l的无菌培养基，于16-45℃培养24-72h，溶氧量控制在100％的空气饱和度。菌悬液或含有其的菌剂制备方法：将上述方法制备的培养液进行1-1000倍稀释获得相应浓度的菌悬液或菌剂，或者将上述方法制备的培养液通过过滤或者离心收集菌体，再将菌体按照1‰-2%加入到相应溶液或固体辅料中获得相应浓度的菌悬液或菌剂产品。

7、本发明还提供了上述还原硝酸盐氮、积累亚硝酸盐氮的异养型反硝化无色杆菌 achromobacter denitrificans pj5、其培养液、其菌悬液、含有其的菌剂在污水处理（尤其是厌氧氨氧化污水脱氮）中的应用。方法一：将上述菌株、其培养液、其菌悬液、含有其的菌剂按照1%-5%的用量或将挂有所述菌株的填料按照5%-20%的用量置于含有硝酸盐氮的污水中或反应器中，处理后的出水流入厌氧氨氧化反应器进行厌氧氨氧化脱氮；方法二：将上述菌株、其培养液、其菌悬液、含有其的菌剂按照1%-5%的用量或将挂有所述菌株的填料按照5%-20%的用量置于厌氧氨氧化反应器出水中，将出水中的硝酸盐氮转化为亚硝酸盐氮，处理后的污水再次回流至厌氧氨氧化反应器中进行深度脱氮。

8、本发明提供了上述还原硝酸盐氮、积累亚硝酸盐氮的异养型反硝化无色杆菌 achromobacter denitrificans pj5、其菌悬液、其培养液、含有其的菌剂在微生物采油、防控油藏酸化以及管道腐蚀中的应用。方法一：在采油的过程中，将上述异养型反硝化无色杆菌 achromobacter denitrificans pj5、其菌悬液、其培养液、含有其的菌剂及营养剂按照1%-5%的用量从油井的油套环空注入油井近井地层，利用该菌的生长代谢防控硫酸盐还原菌导致的油藏酸化。方法二：将上述异养型反硝化无色杆菌 achromobacter denitrificanspj5、其菌悬液、其培养液、含有其的菌剂及营养剂按照1%-5%的用量由注水井注入地下，利用该菌的生长代谢防控硫酸盐还原菌导致的油藏酸化。

9、菌种保藏信息

10、保藏时间：2022年09月07日；

11、保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

12、保藏编号：cgmcc no.25657；

13、保藏单位地址：保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

14、分类命名：反硝化无色杆菌 achromobacter denitrificans。