化合物PhomolideB及其制备方法和在抗菌药物中的应用

化合物phomolide b及其制备方法和在抗菌药物中的应用
技术领域
1.本发明属于医药生物技术领域，具体涉及化合物phomolide b及其制备方法和在抗菌药物中的应用。


背景技术：

2.细菌是许多疾病的病原体，它的感染会引发各种炎症，甚至引起休克性死亡，对人类的生命健康造成巨大的威胁。随着青霉素的问世，抗生素日益快速发展，已成为治疗细菌感染的强力武器。然而，随着抗生素的滥用引发了超级细菌耐药的问题，当前全球每年死于超级细菌感染的人数70万左右。超级细菌中mrsa感染可在牲畜和人之间相互传播，从发现至今，mrsa踪迹几乎遍布全世界，是严重威胁人类生命健康的多重耐药性病原菌。其感染后死亡率高达50％-80％，是医院和社区感染的重要病原菌之一。因而，mrsa感染现已成为世界公共卫生亟待解决的主要难题之一。
3.植物内生真菌(endophytic fungi)是指生活史的一定阶段或全部阶段生活在健康植物组织内，但不对植物组织引起明显病害症状的真菌。内生真菌物种丰富多样，它们处于植物内部的特殊环境中，能够产生各种结构的次生代谢产物，其化合物的结构类型远远超出其植物代谢产物的范围，容易从中发现新颖结构的化合物，并且具有多种生物活性，因此内生真菌已成为发现新天然活性物质的重要资源，在农业和医药工业中具有重要的应用潜力。
4.升振山姜(alpinia shengzhen)为姜科山姜属植物，多年生草本，植株丛生，叶片披针形，花序直立，每个花序有花35-45朵，花大，苞片粉红色，唇瓣黄色，有紫红色条纹，花期2-5月，极具观赏价值，为华南植物园特有的植物。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对现有技术的不足，提供升振山姜内生真菌发现的具有抗菌活性作用的新化合物phomolide b及其制备方法和抗菌应用。
6.本发明的第一个目的是提供式(i)所示的化合物phomolide b
[0007][0008]
本发明的第二个目的是提供化合物phomolide b的制备方法，是从升振山姜内生真菌phomopsis sp.szsj-7b的发酵培养物中分离制备得到的。
[0009]
优选，所述的制备方法，包括以下步骤：
[0010]
a.制备升振山姜内生真菌phomopsis sp.szsj-7b的发酵培养物，分离菌丝体和发酵液，发酵液用乙酸乙酯萃取，萃取液经浓缩后得浸膏；
[0011]
b、浸膏经正相硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯-甲醇作为流动相，从体积比50:1:0到0：10：1梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比为5：1的洗脱液，得到馏分fr.2。fr.2经正相硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂，从体积比100:1到1:1梯度洗脱，收集tlc薄层层析以正己烷:乙酸乙酯＝5:1v/v展开得rf＝0.2-0.5的组分，馏分fr.2-6。fr.2-6再以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂，从体积比20:1到2:1梯度洗脱，收集收集石油醚-乙酸乙酯体积比为5：1的洗脱液，得到馏分fr.2-6-3。馏分fr.2-6-3以石油醚-三氯甲烷为洗脱剂，从体积比20:1到2:1梯度洗脱，收集石油醚-三氯甲烷体积比为2：1的洗脱液，馏分fr.2-6-3-4。该馏分再以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂，从体积比15:1到5:1梯度洗脱，经tlc薄层色谱分析，收集rf值在0.5-0.8的组分，得到馏分fr.2-6-3-4-2。组分fr.2-6-3-4-2经进一步的半制备hplc，获得化合物phomolide b。
[0012]
优选，所述的组分fr.2-6-3-4-2经进一步的半制备hplc获得化合物phomolide b是使用ymcpack ods-a/aq柱，流动相为体积比80:20的乙腈/水，流速为2ml/min，得到化合物phomolide b，tr＝8.0min。
[0013]
优选，所述的步骤a的制备升振山姜内生真菌phomopsis sp.szsj-7b的发酵培养物，包括以下步骤：挑取升振山姜内生真菌phomopsis sp.szsj-7b的菌丝接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，在28℃、120r/min条件下培养5天，制得种子液；然后将种子液按10％的接种量接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，28℃、120r/min条件下培养7天，制得phomopsis sp.szsj-7b的发酵培养物；所述的马铃薯葡萄糖液体培养基，每升是通过以下方法配制的：用500ml的纯水煮200g的马铃薯，煮沸20min，过滤得马铃薯汁；再加入葡萄糖20g、kh2po43g、mgso
4 1.5g、维生素b1 10mg，用水补足至1000ml。
[0014]
本发明的第三个目的是提供所述的化合物phomolide b或其药用盐在制备抗菌药物中的应用。
[0015]
优选，所述的抗菌药物为抗金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林葡萄球菌的药物。
[0016]
本发明的第四个目的是提供一种抗菌药物，其包含有效量的作为活性成分的化合物phomolide b或其药用盐，和药学上可接受的载体。
[0017]
优选，所述的抗菌药物为抗金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林葡萄球菌的药物。
[0018]
本发明还提供升振山姜内生真菌phomopsis sp.szsj-7b在制备化合物phomolide b中的应用。
[0019]
本发明通过实验发现，化合物phomolide b对金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林葡萄球菌mic值为6.25μg/ml，阳性对照物万古霉素对上述两种菌株的mic值为0.78μg/ml。此结果表明：本发明的化合物phomolide b具有比较显著的抗菌活性。
[0020]
本发明从升振山姜内生真菌phomopsis sp.szsj-7b中制备分离得到化合物phomolide b，该化合物phomolide b具有抗菌活性，可以用于制备抗菌药物，为研究与开发新的抗菌药物提供了候选化合物，为开发利用药用植物内生真菌的天然活性物质提供了科学依据。
[0021]
本发明的升振山姜内生真菌phomopsis sp.szsj-7b公开ncbi中(https://
www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/op623444.1)，ncbi登录号是op623444.1，该菌株本技术人也持有，并保证自申请日起20年内向公众提供。
附图说明
[0022]
图1是化合物1(phomolide b)的1h-nmr谱；
[0023]
图2是化合物1(phomolide b)的
13
c-nmr谱；
[0024]
图3是化合物1(phomolide b)的cosy谱；
[0025]
图4是化合物1(phomolide b)的hsqc谱；
[0026]
图5是化合物1(phomolide b)的hmbc谱；
[0027]
图6是化合物1(phomolide b)的noesy谱；
[0028]
图7是化合物1(phomolide b)的hr-esims谱；
具体实施方式
[0029]
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0030]
实施例1：
[0031]
一、升振山姜内生真菌szsj-7b的分离纯化和鉴定
[0032]
本发明的内生真菌szsj-7b是2020年10月从采自广东省中国科学院华南国家植物园姜园的升振山姜的叶中分离得到的，经its序列分析鉴定，genbank基因登录号为：op623444.1，经blast比对，同源分析，鉴定该菌株为phomopsis sp.，命名为phomopsis sp.szsj-7b(下称菌株szsj-7b)。
[0033]
二、菌株szsj-7b的液体发酵
[0034]
培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基，每升培养基是通过以下方法配制的：用500ml的水煮200g的马铃薯，煮沸20min，过滤得马铃薯汁，再加入葡萄糖20g、kh2po
4 3g、mgso41.5g、维生素b
1 10mg、用水补足至1000ml，121℃高压灭菌20min，冷却待用。
[0035]
挑取适量的菌株szsj-7b菌丝接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，在28℃、120r/min条件下培养5天，制得种子液。然后将种子液按体积比10％的接种量接种于装有500ml马铃薯葡萄糖液体培养基的1000ml三角瓶中，共发酵50l，28℃、120r/min条件下培养7天，制得菌株szsj-7b的液体发酵培养物。
[0036]
三、化合物phomolide b的制备
[0037]
50l液体发酵培养物经离心得发酵液和菌丝体，发酵液经乙酸乙酯萃取三遍，合并萃取液，萃取液减压蒸馏，回收溶剂，获得浓缩后的浸膏10g。
[0038]
浸膏经正相硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯-甲醇作为流动相，从体积比50:1:0到0：10：1梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比为5：1的洗脱液，得到馏分fr.2。fr.2经正相硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂，从体积比100:1到1:1梯度洗脱，收集tlc薄层层析以正己烷:乙酸乙酯＝5:1v/v展开得rf＝0.2-0.5的组分，馏分fr.2-6。fr.2-6再以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂，从体积比20:1到2:1梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比为5：1的洗脱液，得到馏分fr.2-6-3。馏分fr.2-6-3以石油醚-三氯甲烷为洗脱剂，从体积比20:1到2:1梯度洗脱，收集收集石油醚-三氯甲烷体积比为2：1的洗脱液，馏分fr.2-6-3-4。该馏分再以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂，从体积比15:1到5:1梯度洗脱，经tlc薄层色谱分析，收
集rf值在0.5-0.8的组分，得到馏分fr.2-6-3-4-2，经进一步的半制备hplc，使用ymcpack ods-a/aq柱，流动相为体积比80:20的乙腈/水，流速为2ml/min，得到化合物phomolide b(2.8mg,tr＝8.0min)。
[0039]
四、化合物phomolide b的结构鉴定
[0040]1h nmr、
13
c nmr、hmbc核磁共振谱图用bruker advance-500核磁共振光谱仪测定，以四甲基硅烷(tms)为内标；esi-ms数据用vg autospec-3000型质谱仪测定；紫外光谱用上海元析仪器有限公司uv6000紫外可见分光光度计测定。
[0041]
如图1-7所示，图1是化合物1(phomolide b)的1h-nmr谱；图2是化合物1(phomolide b)的
13
c-nmr谱；图3是化合物1(phomolide b)的cosy谱；图4是化合物1(phomolide b)的hsqc谱；图5是化合物1(phomolide b)的hmbc谱；图6是化合物1(phomolide b)的noesy谱；图7是化合物1(phomolide b)的hr-esims谱；
[0042]
化合物1(phomolide b)：化合物phomolide b为白色固体(其核磁数据如表1所示)；根据其esims准分子离子峰，确定phomolide b的分子量为384；根据hresims[m+h]
+
m/z385.2007，c
23h29
o5计算值为385.2010，确定化合物的分子式为c
23h28
o5，不饱和度为10；其氢谱和碳谱数据与已知化合物colletotricholide a(zhao et al.,2020),具有较大的相似性，推测该化合物具有杂萜类化合物，这一结论通过详细地分析化合物1的二维核磁谱图得以确证。化合物1的结构应为一个具有c6'未被取代的杂萜类新化合物。
[0043]
表1 phomolide b的核磁数据(δin ppm,j in hz,cd3od)
[0044][0045]
由此确定，化合物1(phomolide b)的化学结构式如式(i)所示。
[0046][0047]
实施例2：
[0048]
采用微量二倍稀释法测试化合物phomolide b的抗菌活性。
[0049]
1、试验用试剂：将制备的化合物phomolide b用二甲基亚砜(dmso)溶解得浓度为1mg/ml的浓度，阳性对照为万古霉素水溶液。
[0050]
本实验所用细菌菌株为金黄色葡萄球菌(cmcc 26003)，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(jcsc 3063)。
[0051]
2、实验方法：首先将供试菌株进行活化(将20％甘油保存的菌株接种于mhb培养基37℃恒温培养12h)，取出活化后的菌悬液稀释到od600＝0.07，此时得到的菌液浓度为108cfu/ml。然后将刃天青显色剂以无菌水配成0.1mg/ml的水溶液，并将刃天青指示剂与待试菌液以3:2的体积比混匀，在96孔板的第一排中加入180μl上述混悬液，后面每排则依次加入100μl。将20μl供试化合物(1mg/ml)、阳性对照、阴性对照依次加入第一排96孔板，每个样品设置2个平行。将供试样品与180μl混悬液混匀后，取出其中的100μl移至第二排混合均匀，再取第二排的100μl移至第三排混合均匀，按照这个方法对三至八排以2倍梯度稀释法依次进行稀释。最后，将该96孔板放在37℃恒温培养箱培养6-12h，观察指示剂颜色变化，确定化合物的mic值。
[0052]
3、实验结果：制备的化合物phomolide b对金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林葡萄球菌mic值为6.25μg/ml，阳性对照物万古霉素对上述两种菌株株的mic值为0.78μg/ml。此结果表明：本发明的化合物phomolide b具有比较显著的抗菌活性。因此，本发明为研究与开发新的抗菌药物提供了候选化合物，为开发利用植物内生真菌的天然活性物质提供了科学依据。