一种诊断是否患有阿尔茨海默病的试剂盒及其用途的制作方法

本技术涉及医药领域、病毒学领域和免疫学领域，特别是免疫学诊断领域。本技术具体涉及一种诊断受试者是否患阿尔茨海默病的试剂盒，以及用于确定生物样品中生物标志物水平的试剂在制备试剂盒中的用途。

背景技术：

1、阿尔茨海默病(alzheimer’s disease, ad)最常见的生物标志物是aβ和tau，它们可以通过脑脊液或pet成像检验。然而这个过程是有创的，且非常昂贵，难以在人群中普遍应用。此外，ad与其他类型的痴呆，如血管性痴呆(vascular dementia, vad)、帕金森病性痴呆(parkinson disease, pdd)、行为变异性额颞叶痴呆(behavioural variantfrontotemporal dementia, bvftd)、路易体痴呆(dementia with lewy bodies, dlb)等，可能存在重叠的临床表现、病理和生物标志物，往往导致临床诊断困难。

2、长非编码rna（long non-coding rna, lncrna）是具有至少200个核苷酸的非编码rna分子的一个亚类。lncrna通过在转录、转录后和翻译后水平上与染色质、dna、rna 和rna 结合蛋白相互作用来发挥生物学作用.越来越多的研究证实了lncrna与ad之间的关系。但是以往的研究样本量小，且未经脑脊液核心标志物证实临床诊断，限制了其临床转化。

3、基于上述问题，ad的临床治疗急需一种可有效诊断ad及鉴别ad与其他类型痴呆的方法。

技术实现思路

1、本技术发明人通过分析两个独立的数据集中ad患者与正常人员的lncrna的差异并使用差异lncrnas组来建立ad诊断模型。并在第三个独立人群中验证了该模型的诊断效能，证实了由血液中7种lncrnas组成的模型能够准确诊断及鉴别诊断ad。因此，本技术的lncrnas有助于ad的诊断。

2、因此，在第一方面，本技术提供了一种用于诊断受试者是否患阿尔茨海默病的方法，其包括：

3、(1)从受试者获得包含生物标志物的生物样品；

4、(2)测定生物样品中生物标志物的水平；

5、(3)基于所述生物标志物的水平，诊断受试者是否患阿尔茨海默病；

6、其中，所述生物标志物为linc02067，linc00987，ankrd34c-as1，norad，thcat158，loc107987206和loc105378179。

7、在某些实施方案中，所述生物样品选自全血(例如，外周血)，血清，血浆或脑脊液。

8、在某些实施方案中，所述生物样品选自全血(例如，外周血)，血清和血浆。在某些实施方案中，在进行步骤(2)之前，对所述生物样品进行预处理，以获得lncrnas；然后进行步骤(2)，即，测定生物标志物的水平。对生物样品(例如全血，血清和血浆)进行处理以获得lncrnas的方法是本领域技术人员已知的。例如，可使用商业化的试剂盒(例如mirneasyserum kit (qiagen, usa)、ribo-off rrna depletion kit (vazyme, inc.))从生物样品(例如全血，血清和血浆)中分离获得lncrnas。

9、在某些实施方案中，在步骤(3)中，通过将所述生物标志物的水平与参考值进行比较，从而诊断受试者是否患阿尔茨海默病。

10、在某些实施方案中，所述生物标志物的水平是lncrna的水平。在此类实施方案中，所述参考值是所述lncrna在获自正常人群的生物样品中的水平或范围。在某些实施方案中， 通过定量pcr(例如，实时荧光定量pcr)来测定所述生物样品中生物标志物的水平。

11、在某些实施方案中，相对于参考值，外周血中linc02067，linc00987，ankrd34c-as1，norad和thcat158的水平的升高表明，受试者患有ad。在某些实施方案中，相对于参考值，外周血中loc107987206和loc105378179的水平的降低表明，受试者患有ad。

12、在某些实施方案中，在步骤(3)中，使用弹性网络回归对所述7种生物标志物的水平进行岭回归，从而获得预测模型；然后，使用所述预测模型预测受试者患神经退行性疾病的风险。

13、在某些实施方案中，所述方法还包括，确定受试者的年龄、性别和apoeε4基因型。在某些优选实施方案中，在步骤(3)中，使用弹性网络回归对所述7种生物标志物的水平进行岭回归，并且用年龄、性别和/或apoeε4基因型进行校正，从而获得预测模型；然后，使用所述预测模型诊断受试者是否患阿尔茨海默病。

14、在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。

15、在某些实施方案中，所述linc02067的序列如seq id no:1所示。在某些实施方案中，所述linc00987的序列如seq id no:2所示。在某些实施方案中，所述ankrd34c-as1的序列如seq id no:3所示。在某些实施方案中，所述norad的序列如seq id no:4所示。在某些实施方案中，所述thcat158的序列如seq id no:5所示。在某些实施方案中，所述loc107987206的序列如seq id no:6所示。在某些实施方案中，所述loc105378179的序列如seq id no:7所示。

16、在某些实施方案中，所述方法能够诊断受试者是否患阿尔茨海默病。

17、在第二方面，提供了一种用于诊断受试者是否患阿尔茨海默病的试剂盒，所述剂盒包含用于确定生物样品中生物标志物水平的试剂，所述生物标志物为linc02067，linc00987，ankrd34c-as1，norad，thcat158，loc107987206和loc105378179。

18、在某些实施方案中，所述试剂盒包含：用于确定受试者的linc02067水平的第一试剂或试剂组合，用于确定受试者的linc00987水平的第二试剂或试剂组合，用于确定受试者的ankrd34c-as1水平的第三试剂或试剂组合，用于确定受试者的norad水平的第四试剂或试剂组合，用于确定受试者的thcat158水平的第五试剂或试剂组合，用于确定受试者的loc107987206水平的第六试剂或试剂组合，用于确定受试者的loc105378179水平的第七试剂或试剂组合。

19、在某些实施方案中，所述试剂(例如第一、第二、第三、第四、第五、第六和/或第七试剂或试剂组合)通过杂交技术来测定所述生物样品中生物标志物的水平。

20、在某些实施方案中，所述杂交技术选自northern印迹分析，微阵列技术，原位杂交，液相芯片技术，夹板连接法。

21、在某些实施方案中，所述第一试剂或试剂组合包含能够定量linc02067的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第二试剂或试剂组合包含能够定量linc00987的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第三试剂或试剂组合包含能够定量ankrd34c-as1的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第四试剂或试剂组合包含能够定量norad的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第五试剂或试剂组合包含能够定量thcat158的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第六试剂或试剂组合包含能够定量loc107987206的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第七试剂或试剂组合包含能够定量loc105378179的水平的引物和/或探针。

22、在某些实施方案中，所述试剂盒具有下列的特征：(1)所述第一试剂或试剂组合包含能够定量linc02067的水平的引物和/或探针；(2)所述第二试剂或试剂组合包含能够定量linc00987的水平的引物和/或探针；(3)所述第三试剂或试剂组合包含能够定量ankrd34c-as1的水平的引物和/或探针；(4)所述第四试剂或试剂组合包含能够定量norad的水平的引物和/或探针；(5)所述第五试剂或试剂组合包含能够定量thcat158的水平的引物和/或探针；(6)所述第六试剂或试剂组合包含能够定量loc107987206的水平的引物和/或探针；(7)所述第七试剂或试剂组合包含能够定量loc105378179的水平的引物和/或探针。

23、在某些实施方案中，所述试剂盒还包括用于捕获生物标志物的工具。在某些实施方案中，所述用于捕获生物标志物的工具位于固体支持物(例如，尼龙膜，微球)上。

24、在某些实施方案中，其中，所述试剂(例如第一、第二、第三、第四、第五、第六和/或第七试剂或试剂组合)通过扩增技术来测定所述生物样品中生物标志物的水平。

25、在某些实施方案中，所述扩增技术选自qpcr，rt-pcr，stem-loop pcr，poly apcr，rca，测序。

26、在某些实施方案中，所述第一试剂或试剂组合包含能够定量linc02067的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第二试剂或试剂组合包含能够定量linc00987的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第三试剂或试剂组合包含能够定量ankrd34c-as1的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第四试剂或试剂组合包含能够定量norad的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第五试剂或试剂组合包含能够定量thcat158的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第六试剂或试剂组合包含能够定量loc107987206的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第七试剂或试剂组合包含能够定量loc105378179的水平的引物和/或探针。

27、在某些实施方案中，所述试剂盒具有下列的特征：(1)所述第一试剂或试剂组合包含能够定量linc02067的水平的引物和/或探针；(2)所述第二试剂或试剂组合包含能够定量linc00987的水平的引物和/或探针；(3)所述第三试剂或试剂组合包含能够定量ankrd34c-as1的水平的引物和/或探针；(4)所述第四试剂或试剂组合包含能够定量norad的水平的引物和/或探针；(5)所述第五试剂或试剂组合包含能够定量thcat158的水平的引物和/或探针；(6)所述第六试剂或试剂组合包含能够定量loc107987206的水平的引物和/或探针；(7)所述第七试剂或试剂组合包含能够定量loc105378179的水平的引物和/或探针。

28、在某些实施方案中，所述试剂盒还包括用于进行核酸扩增的试剂和/或用于进行测序的试剂。

29、在某些实施方案中，所述用于进行核酸扩增的试剂包括，酶(例如核酸聚合酶)的工作缓冲液、dntps(标记或未标记的)、水、包含离子(例如mg2+)的溶液、单链dna结合蛋白、或其任何组合。

30、在某些实施方案中，其中，所述生物样品为获自受试者的全血(例如，外周血)，血清，血浆或脑脊液。在某些实施方案中，所述生物样品选自全血(例如，外周血)，血清和血浆。在某些实施方案中，所述生物样品选自外周血。

31、在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。

32、在某些实施方案中，所述试剂盒还包含，对生物样品进行预处理的预处理试剂或试剂组合。在某些实施方案中，所述预处理试剂或试剂组合用于对所述生物样品(例如全血，血清或血浆)进行预处理，以获得lncrnas。在某些实施方案中，所述预处理试剂或试剂包含lncrnas提取纯化溶液，以及任选的缓冲液。

33、在某些实施方案中，所述试剂盒用于区分患阿尔茨海默病的受试者和正常受试者。

34、在某些实施方案中，所述试剂盒用于区分患阿尔茨海默病的受试者和患其他痴呆(例如，血管性痴呆(vad)、帕金森病性痴呆(pdd)、行为变异性额颞叶痴呆(bvftd)、路易体痴呆(dlb))的受试者。

35、在第三方面，本技术提供了用于确定生物样品中生物标志物水平的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断受试者是否患阿尔茨海默病；其中，所述生物标志物为linc02067，linc00987，ankrd34c-as1，norad，thcat158，loc107987206和loc105378179。

36、在某些实施方案中，所述试剂盒包含：用于确定受试者的linc02067水平的第一试剂或试剂组合，用于确定受试者的linc00987水平的第二试剂或试剂组合，用于确定受试者的ankrd34c-as1水平的第三试剂或试剂组合，用于确定受试者的norad水平的第四试剂或试剂组合，用于确定受试者的thcat158水平的第五试剂或试剂组合，用于确定受试者的loc107987206水平的第六试剂或试剂组合，用于确定受试者的loc105378179水平的第七试剂或试剂组合。

37、在某些实施方案中，所述试剂(例如第一、第二、第三、第四、第五、第六和/或第七试剂或试剂组合)通过杂交技术来测定所述生物样品中生物标志物的水平。

38、在某些实施方案中，所述杂交技术选自northern印迹分析，微阵列技术，原位杂交，液相芯片技术，夹板连接法。

39、在某些实施方案中，所述第一试剂或试剂组合包含能够定量linc02067的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第二试剂或试剂组合包含能够定量linc00987的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第三试剂或试剂组合包含能够定量ankrd34c-as1的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第四试剂或试剂组合包含能够定量norad的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第五试剂或试剂组合包含能够定量thcat158的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第六试剂或试剂组合包含能够定量loc107987206的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第七试剂或试剂组合包含能够定量loc105378179的水平的引物和/或探针。

40、在某些实施方案中，所述试剂盒具有下列的特征：(1)所述第一试剂或试剂组合包含能够定量linc02067的水平的引物和/或探针；(2)所述第二试剂或试剂组合包含能够定量linc00987的水平的引物和/或探针；(3)所述第三试剂或试剂组合包含能够定量ankrd34c-as1的水平的引物和/或探针；(4)所述第四试剂或试剂组合包含能够定量norad的水平的引物和/或探针；(5)所述第五试剂或试剂组合包含能够定量thcat158的水平的引物和/或探针；(6)所述第六试剂或试剂组合包含能够定量loc107987206的水平的引物和/或探针；(7)所述第七试剂或试剂组合包含能够定量loc105378179的水平的引物和/或探针。

41、在某些实施方案中，所述试剂盒还包括用于捕获生物标志物的工具。在某些实施方案中，所述用于捕获生物标志物的工具位于固体支持物(例如，尼龙膜，微球)上。

42、在某些实施方案中，其中，所述试剂(例如第一、第二、第三、第四、第五、第五和/或第六试剂或试剂组合)通过扩增技术来测定所述生物样品中生物标志物的水平。

43、在某些实施方案中，所述扩增技术选自qpcr，rt-pcr，stem-loop pcr，poly apcr，rca，测序。

44、在某些实施方案中，所述第一试剂或试剂组合包含能够定量linc02067的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第二试剂或试剂组合包含能够定量linc00987的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第三试剂或试剂组合包含能够定量ankrd34c-as1的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第四试剂或试剂组合包含能够定量norad的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第五试剂或试剂组合包含能够定量thcat158的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第六试剂或试剂组合包含能够定量loc107987206的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第七试剂或试剂组合包含能够定量loc105378179的水平的引物和/或探针。

45、在某些实施方案中，所述试剂盒具有下列的特征：(1)所述第一试剂或试剂组合包含能够定量linc02067的水平的引物和/或探针；(2)所述第二试剂或试剂组合包含能够定量linc00987的水平的引物和/或探针；(3)所述第三试剂或试剂组合包含能够定量ankrd34c-as1的水平的引物和/或探针；(4)所述第四试剂或试剂组合包含能够定量norad的水平的引物和/或探针；(5)所述第五试剂或试剂组合包含能够定量thcat158的水平的引物和/或探针；(6)所述第六试剂或试剂组合包含能够定量loc107987206的水平的引物和/或探针；(7)所述第七试剂或试剂组合包含能够定量loc105378179的水平的引物和/或探针。

46、在某些实施方案中，所述试剂盒还包括用于进行核酸扩增的试剂和/或用于进行测序的试剂。

47、在某些实施方案中，所述用于进行核酸扩增的试剂包括，酶(例如核酸聚合酶)的工作缓冲液、dntps(标记或未标记的)、水、包含离子(例如mg2+)的溶液、单链dna结合蛋白、或其任何组合。

48、在某些实施方案中，其中，所述生物样品为获自受试者的全血(例如，外周血)，血清，血浆或脑脊液。在某些实施方案中，所述生物样品选自全血(例如，外周血)，血清和血浆。在某些实施方案中，所述生物样品选自外周血。

49、在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。

50、在某些实施方案中，所述试剂盒还包含，对生物样品进行预处理的预处理试剂或试剂组合。

51、在某些实施方案中，所述预处理试剂或试剂组合用于对所述生物样品(例如全血，血清或血浆)进行预处理，以获得lncrnas。

52、在某些实施方案中，所述预处理试剂或试剂包含lncrnas提取纯化溶液，以及任选的缓冲液。

53、在某些实施方案中，所述试剂盒用于区分患阿尔茨海默病的受试者和正常受试者。

54、在某些实施方案中，所述试剂盒用于区分患阿尔茨海默病的受试者和患其他痴呆(例如，血管性痴呆(vad)、帕金森病性痴呆(pdd)、行为变异性额颞叶痴呆(bvftd)、路易体痴呆(dlb))的受试者。

55、在某些实施方案中，所述试剂盒通过上文所述的方法诊断受试者是否患阿尔茨海默病。

56、术语解释

57、如本文中所使用的，术语“神经退行性疾病”是一类进行性发展的疾病，以特异性神经元的大量丢失为主要特征。主要包括帕金森病(parkinson’s disease，pd)，阿尔茨海默病(alzheimer’s disease，ad)，轻度认知功能障碍(mild cognitive impairment，mci)和肌肉萎缩侧缩硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，als)等。

58、如本文中所使用的，术语“阿尔茨海默病(ad)”是老年人常见的神经退行性疾病，以认知功能障碍为主要临床特征。对于ad的诊断可采用磁共振成像(magnetic resonanceimaging，mri)、正电子发射断层显像(positron emission computed tomography,pet)和生物标志物诊断等方法。

59、如本文中所使用的，术语“生物标志物(biomarker)”是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能患的改变的生化指标，具有非常广泛的用途。生物标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。

60、如本文中所使用的，术语“参考值”是指生物标志物的预定值，其是根据对照样品(例如获自正常人群的生物样品)的生物标志物的水平得出的。参考值可以用作阈值，以区分可能存在疾病风险的受试者和不存在该疾病风险的受试者。参考值可以是相对值，有上限和下限的数值范围，平均值，中间值等。本领域技术人员根据现有技术中公开的方法可以选择合适的对照样品、测定并获得参考值。上述方法可以参见，例如，burtis c.a.et al.,2008,chapter 14,section“statistical treatment of reference values，其以全部引用方式并入本文。

61、如本文中所使用的，术语“apoeε4基因型”是指apoe基因的一种变异形式，apoe基因有多种可能的变异形式，例如，ε2ε2、ε3ε3、ε4ε4、ε2ε3、ε2ε4和ε3ε4。一些研究表明，携带apoe基因ε4变异体的人群在晚年更容易发展为阿尔茨海默病。

62、如本文中所使用的，术语“受试者”包括但不限于各种动物，特别是哺乳动物，例如人。

63、如本文中所使用的，术语“app(myloid beta(a4)precursor protein)基因”在早期老年痴呆的发病中起重要作用。目前发现，app基因共有6种错义突变。

64、发明的有益效果

65、本技术的方法能够替代传统的脑脊液的p-tau/aβ检测，通过7种lncrnas实现对ad的诊断，并且，不仅能够区分ad患者与正常人员，还能够区分ad患者与其他痴呆患者(例如，血管性痴呆(vad)、帕金森病性痴呆(pdd)、行为变异性额颞叶痴呆(bvftd)、路易体痴呆(dlb))。本技术的方法仅取血液(例如，外周血)即可完成检测，相较传统的腰椎穿刺脑脊液检测，本技术方法具有以下有益技术效果：(1)具有几乎无创伤，低风险等优势；(2)具有成本低的优势，可在社区或简易的医疗机构完成，受检测人员无需住院；(3)可在大范围人群中筛查ad，使得大范围的老年人口筛查成为可能；(4)无需在医院或专业医疗机构完成；(5)成本低廉。