一种枯草芽胞杆菌沙漠亚种及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种枯草芽胞杆菌沙漠亚种及其应用。


背景技术：

2.黄曲霉毒素(aflatoxin)是一类主要由黄曲霉(aspergillus flavus)、寄生曲霉(a.parasiticus)等真菌产生的次级代谢物。从分子结构上分析，该类毒素是由二呋喃环和香豆素组成的结构类似物。黄曲霉毒素具有极强的致畸、致癌、致突变性，广泛污染花生、玉米、棉籽、稻谷、干果、牛奶等农产品和食品。已被鉴定出的黄曲霉素素有二十多种，其中黄曲霉毒素b1(afb1)分布范围最广，并且毒性最强，并在1993年被世界卫生组织癌症研究机构(iarc)归为ia类致癌物。
3.目前常用的afb1脱除方法主要是物理法和化学法。物理法包括挑拣、漂洗、高温加热、辐射法、溶剂萃取等方法，这些方法要么耗费大量人力物力，效率不高；要么会破坏农产品的营养成分。化学法则是利用氧化剂、氢氧化钠等化学试剂与毒素反应造成毒素降低，但其存在很大的局限性，很多试剂对操作人员的皮肤、眼睛、呼吸道造成伤害，并且化学试剂残留不易去除，影响农产品和食品的质量安全。微生物脱毒法成为近年来的研究热点，该方法主要是利用细菌、真菌等微生物及其代谢产物去除食品中的afb1，该脱毒法对原料无污染、具有高度专一性、同时能避免毒素重新产生，具有降解条件温和、特异性强和脱毒效率高等优点，因此是一种高效、安全的去毒方法。不过，不同的微生物，其脱毒效率显然不同，很多微生物的脱毒效率较低。
4.禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)是引起小麦赤霉病的主要病原菌之一，赤霉病的发生会造成粮食严重减产和籽粒品质下降；而且，在小麦贮存过程中，籽粒本身携带病菌或贮存条件不当也会使小麦籽粒受到禾谷镰刀菌的侵染；该菌侵染小麦后会产生多种真菌毒素，包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮和雪腐镰孢菌烯醇等。这些真菌毒素具有毒性，摄入毒素超标的小麦会造成人和动物机体免疫力下降，导致畸性和癌症，严重危害人和动物健康。因而被禾谷镰刀菌侵染后的小麦籽粒不再适用于磨粉和食用，也不能用作饲料。
5.为了能减少禾谷镰刀菌的危害，人们通过多种方法开展禾谷镰刀菌的防治，主要包括无菌种子、禾谷镰刀菌非宿主作物轮作、抗禾谷镰刀菌的育种、化学防治以及生物防治等。虽然采用无污染的小麦种子和轮种禾谷镰刀菌非宿主作物可以有效降低禾谷镰刀菌的源头污染，但因为禾谷镰刀菌孢子容易扩散等原因，导致这些防治方法作用有限。培育具有禾谷镰刀菌抗性的小麦品种进展缓慢；化学防治虽然有效但长期使用会导致农药残留超标、病原菌耐药性增加，影响小麦食品安全的同时还会造成环境污染；生物防治是一种采用拮抗微生物来抑制禾谷镰刀菌的方法，该方法不仅绿色无污染，而且是效果明显的一种病害防治方式，正越来越受到研究人员的关注。


技术实现要素：

6.本发明提供了一种枯草芽胞杆菌沙漠亚种，所述菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.24427。
7.上述枯草芽胞杆菌沙漠亚种被证明对黄曲霉和禾谷镰刀菌均具有抑制效果，为此，本发明提供了上述枯草芽胞杆菌沙漠亚种在防治黄曲霉和/或禾谷镰刀菌中的应用。其中，在该应用中，对于黄曲霉和/或禾谷镰刀菌的防治，可以是诊疗性的，也可以是非诊疗性的。
8.本发明还提供了上述枯草芽胞杆菌沙漠亚种在提高食品贮藏性能中的应用；其中，所述食品选自易被黄曲霉和/或禾谷镰刀菌侵染的食品，包括但不限于例如花生、小麦、玉米、棉籽、稻谷、干果、牛奶等食品。
9.上述枯草芽胞杆菌沙漠亚种被证明具有黄曲霉毒素降解作用，为此，本发明提供了上述枯草芽胞杆菌沙漠亚种在降解黄曲霉毒素中的应用。其中，所述黄曲霉毒素选自黄曲霉毒素b1。
10.本发明提供了上述枯草芽胞杆菌沙漠亚种在制备具有黄曲霉抑制效果和/或禾谷镰刀菌抑制效果和/或黄曲霉毒素b1降解效果的制剂中的应用。
11.本发明提供了一种微生物制剂，含有上述枯草芽胞杆菌沙漠亚种。
12.本发明提供了一种黄曲霉毒素b1的降解方法，是将上述枯草芽胞杆菌沙漠亚种菌液与黄曲霉毒素b1或含有黄曲霉毒素b1的样品混合，在适宜的温度下孵育，以实现黄曲霉毒素b1的降解。
13.上述降解方法中，所述适宜的温度，是指，适宜本发明所述枯草芽胞杆菌沙漠亚种生长和繁殖的任何温度，例如37℃，或者其它温度。
14.上述降解方法中，孵育时间可选自72h，也可以是其它时长，例如24h、48h等。
15.本发明的有益效果为：
16.本发明提供了一种枯草芽胞杆菌沙漠亚种，该菌能够抑制黄曲霉和禾谷镰刀菌的生长，且对黄曲霉毒素b1具有显著的降解作用。因此，可将该菌应用于黄曲霉和禾谷镰刀菌的防治，以及黄曲霉毒素b1的降解领域，应用前景广阔。
附图说明
17.图1为菌株a12的菌落形态；
18.图2为菌株a12的16s rrna基因的电泳图；其中，泳道1是菌株a12的16s rrna基因，泳道m是dl2000 marker；
19.图3为黄曲霉拮抗试验；其中，中间生长的是黄曲霉，左右两边生长的是菌株a12；
20.图4为菌株a12降解afb1的hplc图谱；其中，a图为对照组，b图为实验组；
21.图5为禾谷镰刀菌拮抗试验；其中，左侧为菌株a12，右侧为禾谷镰刀菌。
具体实施方式
22.菌种分离与鉴定：
23.2017年1月从青岛采集健康的、没有霉变的花生样品，用75％乙醇消毒花生壳，晾干后，在超净台，打开花生，从健康的花生壳内取出部分壳内物质悬浮在10ml无菌水中，震
荡稀释制备土壤悬浊液，然后用无菌蒸馏水稀释100倍。取100μl悬浮液涂布在lb固体平板上，放置于37℃进行培养，3天后平板上长出多个菌落。根据颜色和形态不同，挑取4个菌落在lb固体平板上进行划线纯化，经过3次划线纯化后，经afb1降解试验分析，发现其中一株具有afb1降解能力，将该菌株编号为a12。
24.按照“伯杰细菌鉴定手册”(第八版)中描述的方法，对菌株a12进行形态特征和生理生化特征鉴定，具体结果如下：
25.形态学特征：菌株a12在lb培养基上单菌落凸起，乳白色，不透明(如图1)，在37℃下培养2天后，菌落约为5-7mm。
26.生物学特征：氧化酶活性为阴性，能在4～50℃生长，革兰氏染色为阳性，能水解利用酪蛋白、明胶和淀粉等。
27.基因学特征：提取a12的细菌基因组dna，利用16s rrna基因通用引物进行pcr扩增，扩增产物连接到pmd19-t载体，转化重组质粒到大肠杆菌，测序得到的1511bp基因序列，其16s rrna基因电泳如图2所示。
28.16s rrna基因：
29.[0030][0031]
根据ncbi数据库菌株序列同源性比较，菌株a12的16s rrna基因与标准菌株bacillus subtilis subsp.inaquosorum kctc 13429
t
的16s rrna基因高度同源，其同源性为100％，结合其形态学特征以及生物学特征，将该菌种鉴定为枯草芽胞杆菌沙漠亚种(bacillus subtilis subsp.inaquosorum)。该菌已于2022年02月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为cgmcc no.24427。
[0032]
本发明中所使用的其它术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
[0033]
实施例1
[0034]
黄曲霉拮抗试验：
[0035]
将黄曲霉接种在pda平板，于28℃下培养6天，挑取菌丝于含0.05％吐温-80的无菌水(v/v)中。通过无菌滤纸过滤获得孢子悬液，将孢子浓度调整为1
×
106cfu/ml。采用平板对峙培养法，即，取10μl黄曲霉孢子液接种于pda平板中心，在距离中心约3cm处接种a12，进行拮抗试验。4天后观察pda平板中的生长情况。
[0036]
试验结果如图3所示：黄曲霉未向两侧扩生，这说明，菌株a12能够显著起到拮抗黄曲霉的作用。
[0037]
实施例2
[0038]
afb1降解试验：
[0039]
将1mg黄曲霉毒素b1(afb1)标准品溶解于20ml色谱级甲醇中，配置浓度为50ppm的afb1贮存溶液。取0.5ml 50ppm的afb1，加入4.5ml色谱级甲醇，配置浓度为5000ppb的afb1工作母液。
[0040]
将菌株a12接种于lb培养基中，37℃下孵育48h，至菌液中菌的浓度约为3.6
×
108cfu/ml。取1.96ml的a12菌液置于10ml样品管中，加入40μl5000ppb的afb1工作母液，颠倒混匀后在37℃下孵育72h，然后8000rpm离心5min获得上清，记作实验组溶液；以1.96ml不接菌的培养基加入40μl 5000ppb的afb1工作母液作为对照组，记作对照组溶液。
[0041]
向实验组溶液和对照组溶液中加入甲醇，分别进行萃取，然后使用免疫亲和柱对实验组和对照组溶液萃取后样品的残留毒素进行净化提取，最后使用安装光化学衍生柱的hplc对净化提取得到的样品进行检测。
[0042]
hplc检测条件为：
[0043]
流动相：甲醇：水＝1:1(体积比)；流速0.8ml/min；色谱柱c18(150mm
×
4.6mm，0.5μm)；激发波长350nm，检测波长450nm；进样量20μl；柱温30℃。
[0044]
afb1降解率(％)＝[(对照组afb1含量-实验组afb1含量)/对照组afb1含量]
×
100％
[0045]
结果如图4所示：
[0046]
在37℃条件下，菌株a12对afb1降解效果非常优异，其降解率高达91.2％。
[0047]
实施例3
[0048]
禾谷镰刀菌拮抗试验：
[0049]
将禾谷镰刀菌接种在pda平板，于28℃下培养6天，挑取菌丝于含0.05％吐温-80的无菌水(v/v)中。通过无菌滤纸过滤获得孢子悬液，将孢子浓度调整为1
×
106cfu/ml。采用平板对峙培养法，即，取10μl禾谷镰刀菌孢子液接种于pda平板，并在其旁边接种菌株a12，进行拮抗试验。5天后观察pda平板中的生长情况。
[0050]
试验结果如图5所示：禾谷镰刀菌未向菌株a12侧扩生，这说明，菌株a12能够显著起到拮抗禾谷镰刀菌的作用。
[0051]
应用例1
[0052]
花生粕处理试验：
[0053]
以黄曲霉毒素b1超标的花生粕样品(样品明显生长有黄曲霉)为研究对象，检测菌株a12对花生粕中黄曲霉毒素的降解情况，具体步骤为：
[0054]
设置试验组和对照组，两组所采用的花生粕样品为同一批次样品。对照组：将20g黄曲霉毒素b1超标的花生粕样品，进行灭菌处理，加入10ml的灭菌的发酵培养基；试验组：将20g黄曲霉毒素b1超标的花生粕样品，进行灭菌处理，加入10ml的经lb培养基培养的菌株a12菌液。将试验组和对照组避光，在37℃下孵育72h。
[0055]
试验结果如下所示：
[0056]
经72h孵育后，对照组中黄曲霉毒素b1的含量为125μg/kg，而试验组中黄曲霉毒素b1的含量明显降低至17μg/kg。由此可见，经过菌株a12的处理后，花生粕中的黄曲霉毒素b1可显著降低86.4％。
[0057]
应用例2
[0058]
花生贮藏试验：
[0059]
将黄曲霉接种在pda平板，28℃培养6天，挑取菌丝于含0.05％吐温-80的无菌水(v/v)中。通过无菌滤纸过滤获得孢子悬液，将孢子浓度调整为1
×
106cfu/ml。取相同的花生，设置为2组，分别为试验组和对照组。对照组：在花生中加入黄曲霉孢子。实验组：在花生中同时加入黄曲霉孢子和a12菌液。4天后进行观察。结果显示，对照组的花生表面呈现黄色，有黄曲霉在生长；而实验组的花生表面为正常颜色，没有明显的黄曲霉生长痕迹。这表明，a12菌液可在花生贮藏中发挥重要作用，显著抑制黄曲霉的生长。
[0060]
应用例3
[0061]
小麦贮藏试验：
[0062]
将禾谷镰刀菌接种在pda平板，28℃培养6天，挑取菌丝于含0.05％吐温-80的无菌水(v/v)中。通过无菌滤纸过滤获得孢子悬液，将孢子浓度调整为1
×
106cfu/ml。取相同的小麦，设置为2组，分别为试验组和对照组。对照组：在小麦中加入禾谷镰刀菌孢子。实验组：在小麦中同时加入禾谷镰刀菌孢子和a12菌液。5天后进行观察。结果显示，对照组的小麦表面呈现白毛状物质，有禾谷镰刀菌在生长；而实验组的小麦表面为正常颜色，没有明显的禾谷镰刀菌生长痕迹。这表明，a12菌液可在小麦贮藏中发挥重要作用，显著抑制禾谷镰刀菌的生长。
[0063]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。