一种纳米复合催化剂及一步法测定糖化白蛋白的方法

1.本发明属于纳米催化材料及生物医学技术领域，具体涉及到一种纳米复合催化剂及一步法测定糖化白蛋白的方法。


背景技术：

2.糖化白蛋白是血液中的葡萄糖与血清白蛋白通过非酶糖化反应所形成的产物，可有效反映人体既往2-3周的平均血糖水平，不受患者个体血红蛋白代谢紊乱、血清总蛋白和白蛋白浓度、肌酐、尿酸、胆红素等因素的影响，结果精准可靠，有助于医疗人员全面、精确的了解患者的真实病情。糖化白蛋白在糖尿病、肾病综合征、心脑血管病、胰腺癌等疾病的筛查和诊断，尤其是对临床上已确诊糖尿病患者的病情观察和疗效监测具有重要价值。
3.目前检测糖化白蛋白的方法主要有：高效液相色谱法和酮胺氧化酶法。
4.高效液相色谱法检测结果准确，但是需要专业、昂贵的高效液相色谱仪和专业的技术人员，不适合基层医院和院外患者自检。
5.酮胺氧化酶法是将生物催化与显色反应结合来实现糖化白蛋白检测，特异性和灵敏度高、精密度好、抗干扰能力强、线性范围宽、对设备与人员要求低，是一种比较理想的检测糖化白蛋白的方法。但是，酮胺氧化酶法需要先后使用蛋白酶、酮胺氧化酶和过氧化物酶这三种生物酶催化三个串联反应来实现，操作繁琐，整个检测过程耗时超过3h。酮胺氧化酶法具体操作与反应过程主要有：1)蛋白酶与糖化白蛋白反应释放糖化氨基酸；2)糖化氨基酸在酮胺氧化酶的催化下，特异性氧化酮胺键，释放出h2o2；3)h2o2在过氧化物酶的作用下与底物发生氧化显色反应，通过颜色的变化对糖化白蛋白进行定量测定。三个串联反应环环相扣，任何一个环节的微小差错都可能影响测定结果的准确性。同时，酮胺氧化酶法所使用的三种生物酶本质上都是蛋白质，存在稳定性差(易受酸、碱、热、有机溶剂等因素的影响而失去活性)、价格昂贵、难以储存等局限性，限制了在糖化白蛋白临床检测中的应用。如何快速、便捷、准确的检测糖化白蛋白成为亟需解决的技术难点。
6.因此，本领域需要一种新的快速、便捷、准确测定糖化白蛋白的方法。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种纳米复合催化剂及一步法测定糖化白蛋白的方法，以解决背景技术中提出的如何快速、便捷、准确的检测糖化白蛋白的问题。
8.本发明提供了一种纳米复合催化剂，所述纳米复合催化剂的制备过程为：
9.先对过氧化物酶纳米模拟酶进行醛基化修饰得到cho-纳米酶，然后将cho-纳米酶与蛋白酶和酮胺氧化酶偶联得到纳米复合催化剂。
10.在一种具体的实施方式中，所述过氧化物酶纳米模拟酶包括：纳米fe3o4、纳米cofe3o4、纳米co3o4、纳米ceo2、纳米mno、纳米mos2和纳米ws2中的一种或多种。过氧化物酶纳米模拟酶是一种新型人工模拟酶，具有与天然过氧化物酶类似的催化功能，能催化h2o2产生活性氧自由基，且粒径小、负载能力强、稳定性好、催化活性可调、生物相容性好、价廉易得、
易于修饰改性与工业化生产，具备作为优良载体的先决条件。
11.在一种具体的实施方式中，所述过氧化物酶纳米模拟酶的粒径为1～1000nm。
12.在一种具体的实施方式中，所述过氧化物酶纳米模拟酶醛基化修饰的过程如下：
13.将过氧化物酶纳米模拟酶加入到壳聚糖溶液中，完全混匀后，加入多聚磷酸钠溶液，室温反应一段时间，分离收集壳聚糖修饰的过氧化物酶纳米模拟酶；经超纯水和冰醋酸溶液反复清洗干净后重新分散到pbs缓冲液中；然后加入高碘酸钠溶液进行反应；再次清洗后收集cho-纳米酶。
14.在一种具体的实施方式中，所述壳聚糖溶液的质量百分比浓度为0.05～0.2％；多聚磷酸钠溶液的质量百分比浓度为0.5～5.0％；冰醋酸溶液的质量百分比浓度为0.5～1.5％；高碘酸钠溶液的质量百分比浓度大于等于1.0％；所述pbs缓冲液的ph值为1.5～6.5。
15.在一种具体的实施方式中，将cho-纳米酶与蛋白酶和酮胺氧化酶偶联得到纳米复合催化剂的过程如下：
16.将cho-纳米酶完全分散在水中，然后分别加入蛋白酶溶液和酮胺氧化酶溶液；混匀后进行偶联，偶联结束后进行分离、清洗，得到纳米复合催化剂。
17.在一种具体的实施方式中，所述偶联反应的温度控制在0～8℃；所述偶联反应的时间为1～4小时；所述蛋白酶溶液的质量百分比浓度为0.1～1.00％；酮胺氧化酶溶液的质量百分比浓度为0.1～1.00％。
18.本发明还提供了一种一步法测定糖化白蛋白的方法，包括以下步骤：
19.将前述的纳米复合催化剂加入至糖化白蛋白待测溶液中，接着加入tmb溶液反应一段时间，观察结果，反应结束后的溶液颜色变蓝即存在糖化白蛋白，且随糖化白蛋白待测溶液中的糖化白蛋白浓度的增加而蓝色变深。
20.在一种具体的实施方式中，所述tmb溶液为1～500μmol/l的tmb溶液。
21.在一种具体的实施方式中，所述tmb溶液为50～300μmol/l的tmb溶液。若tmb溶液低于50μmol/l则肉眼较难分辨显色差异，需借助精密仪器，而若tmb溶液高于300μmol/l，则在反应生成oxtmb时颜色过深甚至沉淀，也不利于观察与测定。
22.本发明的有益效果包括：
23.1、高效液相色谱法需要专业、昂贵的高效液相色谱仪和专业的技术人员，不适合基层医院和院外患者自检。酮胺氧化酶法操作繁琐，耗时较长，且所需试剂价格昂贵、稳定性差、难以储存。本发明使用复合催化剂，融合了蛋白酶、酮胺氧化酶和过氧化物酶的三重功能，通过级联反应一步检测糖化白蛋白，能简化操作、提高检测效率和准确性。
24.2、采用过氧化物酶纳米模拟酶取代过氧化物酶，提高了催化剂的稳定性，降低了成本。
25.本发明过氧化物酶纳米模拟酶负载蛋白酶和酮胺氧化酶制备的复合催化剂兼具蛋白酶、酮胺氧化酶和类过氧化物酶三种催化剂的功能，不需要使用高效液相色谱仪、过氧化物酶等昂贵仪器和材料，且检测中只需要加入待测样品即可一步实现检测，操作方便、结果准确，特别适合在急诊科、基层医院和家庭化验。
26.3、本发明中过氧化物酶纳米模拟酶采用的主要是纳米fe3o4、cofe3o4、co3o4、ceo2、mno等金属氧化物纳米粒子及mos2、ws2等纳米粒子，此类纳米原料价格便宜、制备简单、生物
相容性好、同时也便于工业化生产。
27.除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
28.构成本技术的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
29.图1为实施例3选用的纳米fe3o4的透射电镜图；
30.图2为实施例3制备的cho-纳米酶的透射电镜图；
31.图3为实施例3制备的纳米复合催化剂电泳图；
32.图4为纳米复合催化剂一步法测定糖化白蛋白的检测结果图；
33.图5为对照组1测定糖化白蛋白检测结果图；
34.图6为对照组2测定糖化白蛋白检测结果图；
35.图7为纳米复合催化剂一步法测定糖化白蛋白的极限浓度检测结果图；
36.图8为纳米复合催化剂集成串联催化一步法测定糖化白蛋白的示意图。
具体实施方式
37.以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
38.实施例1
39.1)过氧化物酶纳米模拟酶醛基化修饰
40.将10mg纳米mno加入到10ml质量百分比浓度为0.1％的壳聚糖溶液中，完全混匀后，加入1ml质量百分比浓度为0.5％的多聚磷酸钠溶液，室温反应30min，分离收集壳聚糖修饰的纳米酶。经超纯水和1％冰醋酸溶液反复清洗干净后分散到10mlph为2.0的pbs缓冲液中。然后加入1ml质量百分比浓度为1.0％的高碘酸钠溶液，室温反应3.5h。再次清洗后收集cho-纳米酶。cho-纳米酶即醛基化修饰的过氧化物酶纳米模拟酶。
41.2)纳米复合催化剂的制备
42.将cho-纳米酶完全分散在10ml水中，然后分别加入1ml质量百分比浓度为0.10％的蛋白酶溶液和1ml质量百分比浓度为0.10％的酮胺氧化酶溶液。混匀后4℃下进行偶联1.0h，偶联结束后进行分离、清洗，得到纳米复合催化剂。
43.实施例2
44.1)纳米酶醛基化修饰
45.将10mg纳米co3o4加入到10ml质量百分比浓度为0.1％的壳聚糖溶液中，完全混匀后，加入1ml质量百分比浓度为1.0％的多聚磷酸钠溶液，室温反应30min，分离收集壳聚糖修饰的纳米酶。经超纯水和质量百分比浓度为1％的冰醋酸溶液反复清洗干净后分散到10mlph为3.0的pbs缓冲液中。然后加入1ml质量百分比浓度为2.0％的高碘酸钠溶液，室温反应3.5h。再次清洗后收集cho-纳米酶。
46.2)复合催化剂的制备
47.将cho-纳米酶完全分散在10ml水中，然后分别加入1ml质量百分比浓度为0.25％
的蛋白酶溶液和1ml质量百分比浓度为0.25％的酮胺氧化酶溶液。混匀后4℃下进行偶联1.5h，偶联结束后进行分离、清洗，得到纳米复合催化剂。
48.实施例3
49.1)纳米酶醛基化修饰
50.将10mg纳米fe3o4加入到10ml质量百分比浓度为0.1％的壳聚糖溶液中，完全混匀后，加入1ml质量百分比浓度为5.0％的多聚磷酸钠溶液，室温反应30min，分离收集壳聚糖修饰的纳米酶。经超纯水和质量百分比浓度为1％的冰醋酸溶液反复清洗干净后分散到10mlph为4.0的pbs缓冲液中。然后加入1ml质量百分比浓度为3.0％的高碘酸钠溶液，室温反应1.5h。再次清洗后收集cho-纳米酶。
51.2)复合催化剂的制备
52.将cho-纳米酶完全分散在10ml水中，然后分别加入1ml质量百分比浓度为0.50％的蛋白酶溶液和1ml质量百分比浓度为0.50％的酮胺氧化酶溶液。混匀后4℃下进行偶联2.0h，偶联结束后进行分离、清洗，得到纳米复合催化剂。
53.实施例4
54.1)纳米酶醛基化修饰
55.将10mg纳米ceo2加入到10ml质量百分比浓度为0.1％的壳聚糖溶液中，完全混匀后，加入1ml质量百分比浓度为5.0％的多聚磷酸钠溶液，室温反应30min，分离收集壳聚糖修饰的纳米酶。经超纯水和质量百分比浓度为1％的冰醋酸溶液反复清洗干净后分散到10mlph为5.0的pbs缓冲液中。然后加入1ml质量百分比浓度为5.0％的高碘酸钠溶液，室温反应3.5h。再次清洗后收集cho-纳米酶。
56.2)复合催化剂的制备
57.将cho-纳米酶完全分散在10ml水中，然后分别加入1ml质量百分比浓度为0.75％的蛋白酶溶液和1ml质量百分比浓度为0.75％的酮胺氧化酶溶液。混匀后4℃下进行偶联2.0h，偶联结束后进行分离、清洗，得到纳米复合催化剂。
58.实施例5
59.1)纳米酶醛基化修饰
60.将10mg纳米mos2加入到10ml质量百分比浓度为0.1％的壳聚糖溶液中，完全混匀后，加入1ml质量百分比浓度为5.0％的多聚磷酸钠溶液，室温反应30min，分离收集壳聚糖修饰的纳米酶。经超纯水和质量百分比浓度为1％的冰醋酸溶液反复清洗干净后分散到10mlph为6.0的pbs缓冲液中。然后加入1ml高碘酸钠饱和溶液，室温反应3.5h。再次清洗后收集cho-纳米酶。
61.2)复合催化剂的制备
62.将cho-纳米酶完全分散在10ml水中，然后分别加入1ml质量百分比浓度为1.00％的蛋白酶溶液和1ml质量百分比浓度为1.00％的酮胺氧化酶溶液。混匀后4℃下进行偶联3h，偶联结束后进行分离、清洗，得到纳米复合催化剂。
63.实施例6
64.纳米复合催化剂一步法测定糖化白蛋白实验
65.选定实施例三所制备的纳米复合催化剂为实验组，以糖化白蛋白测定试剂盒(酮胺氧化酶法)为对照组。对照组中试剂加入量按照说明书操作进行，催化剂的加入方式分别
为：
66.对照组1，蛋白酶、酮胺氧化酶和过氧化物酶依次每隔2分钟的方式加入；
67.对照组2，一开始将蛋白酶、酮胺氧化酶和过氧化物酶全部加入。
68.取5μg纳米复合催化剂分别加入到1.0ml质量百分比浓度分别为10.0％、8.0％、6.0％、4.0％、2.0％的糖化白蛋白溶液中，随后在反应体系中再加入100μl的100μmol/l的tmb溶液，反应10min，观察结果。从结果可以明显看出，采用本发明制备的纳米复合催化剂一步法测定糖化白蛋白在10分钟后五个浓度的组均明显变蓝，且颜色随糖化白蛋白浓度的增加明显变深，而两个对照组颜色变化不明显。
69.实施例7
70.纳米复合催化剂一步法测定糖化白蛋白的极限浓度
71.更进一步，考察了实施例三所制备的纳米复合催化剂一步法测定糖化白蛋白的极限浓度。具体操作为：取5μg纳米复合催化剂加入到1.0ml质量百分比浓度为0.05％的糖化白蛋白溶液中，随后在反应体系中再加入100μl的100μmol/l的tmb溶液，反应10min，观察结果。
72.从结果可以看出，实验组成浅蓝色，取1μl的反应液滴加在白色纸上，可以在纸片上看见明显的蓝色印记。说明本发明制备的纳米复合催化剂对糖化白蛋白检测灵敏度高，检测极限可以达到0.05％。
73.本发明的纳米复合催化剂具有以下优点：(1)具有蛋白酶、酮胺氧化酶和过氧化物酶三种催化性能，可以催化集成串联反应，反应过程中产生的糖化氨基酸和h2o2等中间产物通过原位反应的方式迅速进入下一步反应，整个串联反应在30分钟内即可完成，减少了常规串联反应中中间产物释放与进入下一步反应所需要克服的扩散距离和空间位阻，提高反应效率与检测灵敏度；(2)粒径小，可以提高催化剂的分散性与比表面积，增大与底物分子间的有效碰撞几率，提高反应速度；(3)减小载体的空间位阻与对游离酶的屏蔽作用，防止催化活性降低；(4)调节生物酶的空间结构与分子构象，使构象更加坚固，提高稳定性。
74.本发明中的一步法测定糖化白蛋白的方法实现了糖化白蛋白的快速、便捷、准确检测，能缩短检测时间、简化操作步骤、提高检测的准确性、降低检测费用，具有极大的市场价值。
75.纳米复合催化剂的检测原理是：
76.当待测样品中含有糖化白蛋白时，糖化白蛋白先与纳米复合催化剂上的蛋白酶发生水解反应，生成的糖化氨基酸迅速与纳米复合催化剂上的酮胺氧化酶发生原位反应产生h2o2，h2o2在纳米复合催化剂上的过氧化物酶纳米模拟酶的催化下与tmb迅速发生原位反应生成蓝色氧化产物oxtmb。反应结束后测定吸光值大小即可实现糖化白蛋白定量检测。
77.纳米复合催化剂集成串联催化一步法测定糖化白蛋白的反应机理如下式：
[0078][0079]
本发明提供了一种体外检测糖化白蛋白的纳米复合催化剂及糖化白蛋白的一种新的检测方法，缩短了检测时间、简化了操作步骤、提高了检测的准确性、降低了检测费用。
[0080]
本发明的纳米复合催化剂具有蛋白酶、酮胺氧化酶和过氧化物酶纳米模拟酶三种催化剂的催化性能，能催化糖化白蛋白通过集成串联反应与tmb迅速反应，在30分钟内即可
生成蓝色产物oxtmb，然后测定吸光值即可对糖化白蛋白进行定量测定。本发明的纳米复合催化剂能有效提高检测的效率和灵敏度，实现糖化白蛋白的一步法检测。
[0081]
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演和替换，都应当视为属于本发明的保护范围。