CA12基因作为特异性标记在区分瘤胃与非瘤胃上皮细胞及检测其发育程度方面的应用

本发明涉及一种特异性标记，特别涉及一种ca12基因作为特异性标记在区分瘤胃与非瘤胃上皮细胞及检测其发育程度方面的应用，属于反刍动物消化道发育调控。

背景技术：

1、反刍动物的胃为复胃，分瘤胃、网胃、瓣胃和皱胃四个胃室。成年后，瘤胃约占四个胃室总容积的80％，是迄今已知的降解纤维物质能力最强的天然发酵罐，是反刍动物产能的主要场所，因此也是研究人员关注的核心器官。但是研究人员更多关注的是瘤胃独特的生态体系，体系中微生物种群之间，以及与宿主机体之间的相互联系和相互制约关系(therumen microbial ecosystem,ed.hobson and stewart)，而忽略了瘤胃实体结构发育过程的复杂调控网络。孤立地关注瘤胃，不是发挥反刍动物生产效率最大化的选择。虽然早在二十世纪五十年代研究人员就已描述复胃在胎儿期和出生后的生长发育特点，及采食过程中出现的食管沟反射和反刍等机能，但就原肠分化为瘤、网、瓣、皱四个室的调节机制，四个室的细胞组成及其时空变化，瘤胃与网胃、瓣胃和皱胃间功能协同的调节机制仍是反刍动物生理学需要回答的从0到1的科学问题。揭示和利用复胃的分阶段发育机制，协调四个胃室的发育，充分发挥出复胃功能，必将使反刍动物营养物质利用效率从本质上获得提升。

2、目前，对于复胃上皮细胞的研究大多集中于瘤胃上皮细胞层面，国内外已有文献相继报道从奶牛、山羊和绵羊的瘤胃上皮组织分离了瘤胃上皮细胞并建立了奶牛和湖羊的长期瘤胃上皮细胞培养体系，为进一步研究瘤胃上皮基因的功能、营养素吸收代谢和微生物粘附机理研究提供功能性的细胞素材。然而，通过复胃上皮细胞共培养从而揭示反刍动物复胃分阶段协调发育机制是尚未触及的科学问题；此外，尚缺乏从瘤、网、瓣、皱四个胃的混合上皮细胞样本中区分瘤胃上皮细胞的特异性标志物，且无法反映其瘤胃上皮功能的发育程度。因此，寻找一种在复胃组织和细胞共培养时定位瘤胃上皮细胞并反映其发育程度的特异性标记迫在眉睫。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种ca12基因作为特异性标记在区分瘤胃与非瘤胃上皮细胞及检测其发育程度方面的应用。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

3、一种ca12基因作为特异性标记在从瘤胃和非瘤胃的混合上皮细胞中定位瘤胃上皮细胞并检测瘤胃上皮细胞发育程度方面的应用。本发明中所述非瘤胃是指网、瓣、皱三个胃。所述的瘤胃动物是指奶牛、山羊或绵羊，尤其是山羊或绵羊。

4、作为优选，所述的特异性标记ca12基因位于绵羊7号染色体，genbank登录号为190689508，该登陆基因序列全长65070bp，其cds核苷酸序列如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3和seq id no.4所示。

5、作为优选，所述的ca12蛋白氨基酸序列如seq id no.5所示。

6、作为优选，该应用是通过荧光定量检测ca12mrna表达水平以判断并定位瘤胃上皮细胞，具体包括以下步骤：

7、提取待检测组织/细胞样本的总rna，将其反转录为cdna，应用ca12基因和内参基因gapdh特异性dna标记进行qpcr扩增；计算ca12基因相对于内参基因gapdh的表达量，不同待测组织/细胞样本间的比较采用单因素方差分析(anova)进行显著性分析。随着日龄的增加ca12基因相对表达量增加并且显著性高于其他上皮组织/细胞的待测样本为瘤胃上皮细胞(p<0.05)。

8、作为优选，该应用是通过wb试验检测ca12蛋白表达水平以判断并定位瘤胃上皮细胞，具体包括以下步骤：

9、采用待检测组织/细胞样本的总蛋白，应用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白；将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白转至nc/pvdf膜上，采用ca12和内参β-actin特异性抗体检测ca12和内参β-actin蛋白；应用ecl显色法显色；计算ca12蛋白相对于内参β-actin蛋白的表达量，不同待测组织/细胞样本间的比较采用单因素方差分析(anova)进行显著性分析。随着日龄的增加ca12蛋白相对表达量增加并且显著性高于其他上皮组织/细胞的待测样本为瘤胃上皮细胞(p<0.05)。

10、作为优选，该应用是通过免疫荧光和ca12特异性抗体检测组织切片/细胞样本中ca12的信号以判断并定位瘤胃上皮细胞，在组织切片或细胞中，检测到ca12荧光信号的为瘤胃上皮细胞；不能检测到ca12荧光信号的为非瘤胃上皮细胞；

11、所述ca12特异性抗体的抗原序列为：

12、s kwtyigpdge kswsktypsc ggllqspidl hndilrynas lgplafqgyn qsaspqfvltnnghsvkvkl pkdmqvrglg arynasqlhl hwgdkndphg sehtvggkhf aaelhivyyn sdrypndsvakdkpeglavv avlievgssn paydkifdhl kavkykdqev fipgfsieel lperpeeyyr yrgslttppcyptvlwtvfr npvqisqeql mkletdlyct hmddpsprem vnnfrqvqkf d，其氨基酸序列如seq idno.6所示。

13、作为优选，该应用是通过荧光定量检测瘤胃组织/细胞样本中ca12mrna表达水平从而反映瘤胃上皮细胞发育程度，具体包括以下步骤：提取待检测组织/细胞样本的总rna，将其反转录为cdna，应用ca12基因和内参基因gapdh特异性dna标记进行qpcr扩增；计算ca12基因相对于内参基因gapdh的表达量。待检瘤胃组织/细胞ca12表达量越高，待检组织/细胞瘤胃发育越成熟。

14、作为优选，通过荧光定量检测ca12mrna表达水平以判断并定位瘤胃上皮细胞的和检测瘤胃上皮发育程度的应用中，用于qpcr扩增所述的ca12基因的特异性引物为：

15、ca12-forward primer：5’-ggccactcagtgaaggtgaa-3’，其核苷酸序列如seq idno.7所示；

16、ca12-reverse primer：5’-ggaggagcccacctctatga-3’，其核苷酸序列如seq idno.8所示。

17、本发明所述的特异性标记ca12基因位于绵羊7号染色体，编码ca12蛋白，其特异性引物和抗体是根据ca12基因序列和ca12蛋白序列所设计的。试验证明，该ca12基因、蛋白及其引物和抗体能够用于从瘤、网、瓣、皱四个胃的混合上皮细胞样本中定位瘤胃组织/细胞，其表达量的大小能够反映瘤胃上皮细胞的发育程度，具有特异性高、成本低、高通量的优点。

18、本发明所提供的用于分析ca12基因在瘤胃上皮细胞表达的方法，是利用实时荧光定量技术和western blot蛋白免疫印迹技术分析ca12在待测样品中的表达情况。

19、本发明所提供的指征ca12基因在瘤胃上皮细胞的方法，是利用免疫荧光技术和免疫组化技术检测待检样品冷冻组织切片或细胞中ca12的定位。

20、本发明所提供的用于反映瘤胃发育程度的方法，是测定ca12的表达量，表达量越高，待检样品瘤胃发育越成熟。

21、本发明所述的实时荧光定量技术分析ca12在待检样品中的表达情况，通过提取总rna，采用反转录方法获得不同组织/细胞样品cdna，然后进行实时荧光定量分析。

22、本发明所述的western blot蛋白免疫印迹技术分析ca12在待检样品中的表达情况，是通过提取总蛋白，根据ca12(29-291aa)作为免疫原序列设计ca12抗体，然后进行western blot蛋白免疫印迹分析。

23、本发明所述的免疫荧光技术从瘤、网、瓣、皱四个胃的混合上皮细胞样本中定位瘤胃上皮细胞的方法，是通过制作待检样品冷冻切片，应用ca12特异性抗体，观察ca12信号和染色情况。

24、本发明所提供的ca12基因反映瘤胃发育程度的方法，是通过检测ca12基因的表达量与瘤胃发育代谢功能指标以及瘤胃发育表观指标两方面的相关性来判定。

25、本发明选择与瘤胃吸收和代谢有关基因作为筛选反映瘤胃发育代谢功能有关的分子标记的依据，这些基因包括：hmgcs2、hmgcl和bdh1；hmgcs2基因编码3-羟基-3-甲基-戊二酸单酰辅酶a(hmg-coa)合成酶，分布于线粒体中，可以有效地控制瘤胃生成酮体的速度，是调控瘤胃上皮细胞酮体合成的反应限速酶，也是反刍动物最主要的生酮调节酶。hmgcs2在反刍动物瘤胃中的含量越高，表明其瘤胃的生酮能力越强。hmgcl基因编码hmg-coa裂解酶裂解hmg-coa，生成乙酰-coa和乙酰乙酸，是酮体合成的关键步骤。bdh1编码β-羟丁酸脱氢酶催化乙酰乙酸的还原，生成β-羟丁酸(bhba或βohb)，并进入血液循环。反刍动物瘤胃上皮细胞线粒体内的生酮过程是依赖于以上三个酶的协同作用，早期的研究已经证实，hmg-coa合成酶被认为是瘤胃上皮发育成熟的标志点，随着日龄的增加，hmgcs2、hmgcl、bdh1的mrna水平升高，表明瘤胃上皮代谢功能的增强。

26、本发明选择与瘤胃发育相关的表观指标包括瘤胃重量、瘤胃重量/体重、瘤胃上皮乳头宽度与长度。

27、本发明提供了ca12基因在山羊瘤胃上皮转录组的表达情况，并分析了绵羊和山羊ca12基因表达量与日龄的相关性。

28、本发明提供的分子标记基因特异性高(即准确度高)，能够清晰的从瘤、网、瓣、皱四个胃的混合上皮细胞样本中定位瘤胃上皮细胞并反映其吸收和代谢scfa相关基因的表达量，特别适用于瘤胃发育的研究中。因此，本发明为研究湖羊瘤胃发育提供了有利工具。

29、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

30、1、通过荧光定量检测ca12 mrna表达水平以判断并定位瘤胃上皮细胞，随着日龄的增加ca12基因相对表达量增加并且显著性高于其他上皮组织/细胞的待测样本为瘤胃上皮细胞(p<0.05)；

31、2、通过wb试验检测ca12蛋白表达水平以判断并定位瘤胃上皮细胞，随着日龄的增加ca12蛋白相对表达量增加并且显著性高于其他上皮组织/细胞的待测样本为瘤胃上皮细胞(p<0.05)；

32、3、通过免疫荧光和ca12特异性抗体检测组织切片/细胞样本中ca12的信号以判断并定位瘤胃上皮细胞，在组织切片或细胞中，检测到ca12荧光信号的为瘤胃上皮细胞；不能检测到ca12荧光信号的为非瘤胃上皮细胞；

33、4、ca12基因表达量与hmgcs2、hmgcl和bdh1呈显著正相关(p≤0.05且r≥0.40)，ca12基因表达量与瘤胃重量呈显著正相关(p≤0.05且r≥0.40)，待检瘤胃组织/细胞ca12表达量越高，待检组织/细胞瘤胃功能发育越成熟。本发明的ca12基因、蛋白及其特异性引物和抗体可用于从mrna或蛋白水平鉴定瘤胃上皮细胞，其表达量高低能够反映瘤胃发育的程度。