一株植物乳杆菌Y1和巴氏毕赤酵母Y2及其益生菌制剂和应用

一株植物乳杆菌y1和巴氏毕赤酵母y2及其益生菌制剂和应用
技术领域
1.本发明涉及一株菌及其应用，尤其涉及一株植物乳杆菌y1和巴氏毕赤酵母y2及其益生菌制剂和应用，属于动物营养免疫领域。


背景技术：

2.随着经济水平的提高，饲养伴侣动物的人数逐年增长，宠物的健康问题越发受到人们的关注。狂犬病为国家兽医防控中二类疫病，为人兽共患病。据统计中国每年免疫注射狂犬疫苗的人数达到四千万，由犬损伤人引发的狂犬病约占总数的95％，全国每年被动物致伤进行狂犬病预防处置的人数超1000万。同时，缺乏运动造成犬免疫抗病力下降；犬的狂犬疫苗保护效价降低，加剧了此病的发生。在临床上，宠物免疫接种能否成功，不但取决于接种疫苗的质量、接种途径和免疫程序等外部条件，还取决于机体的免疫系统的应答能力和机体健康状态。随着微生态制剂的不断研究发现，乳酸菌能促进动物生长，维持肠道菌群平衡，抑制病原菌在动物肠道内粘附，加强动物机体免疫力等效果。某些种类益生菌，可帮助宠物机体维持健康状态并调节免疫机能。给宠物犬补充益生菌、提高犬只免疫力，同时提高犬注射狂犬疫苗后抗体水平，提高保护效价，值得研究推广。
3.在犬的饲养管理中，犬只以圈养为主；加上新冠疫情的留行，人员流动的限制，遛狗行为受到疫情的约束。犬日粮中富含蛋白质、低纤维，排泄物中仍存在大量未消化的粗蛋白。犬的排泄物容易发酵产生有害物质是氨气、粪臭素、硫化氢氨等。这些成分加在一起产生的异味，散发到空气中产生不友好气味。通常情况下，只要不在非常封闭的空间内，气体的浓度不会太高，远远低于能引起急性中毒的浓度。但异味会让人体感到不适，由于环境恶化带来的诸多不良效应，环境保护越发受到重视，健康绿色的环境倍受人们的推崇。为了消除异味，人们选择宠物除臭剂来解决这个问题。但目前由于除臭剂的成本较高，且不能从根本上解决粪便发酵带来问题。某些种类益生菌，可改善肠道菌群结构，减少有害菌和腐败菌的数量，提高有益菌数量，不仅增强了机体免疫能力，也减少了粪便发酵产生有害气体，如果合理补充此类益生菌，对宠物犬养殖起到一举两得的效果。
4.根据《2020年中国宠物益生菌行业白皮书》报道，在中国，益生菌的产业链中最为核心部分是菌种资源，仍重度依赖于国外进口，原材料供应市场几乎被杜邦等国外龙头企业垄断，据统计，仅美国杜邦和丹麦科汉森两家公司就占据中国益生菌制剂的产品市场总额的85％。而中国生产的益生菌，尚处于起步阶段。
5.虽然高新磊等人(复合益生菌喷雾制剂对肉鸡生产性能、免疫功能、鸡舍空气微生物及有害气体的影响，2022)、邹强强等人(复合益生菌制剂对叠层笼养白羽肉鸡生长性能、血液指标、粪便中有害气体排放量以及菌群数量的影响，2022)报道益生菌可提高鸡免疫功能，降低鸡舍内大肠杆菌数量。周时均(益生菌应用于规模化肉鸡养殖的经验交流，2022)报道指出益生菌可改善规模化养殖中，鸡体的免疫力。张旋(益生菌发酵对饲料品质、猪粪菌菌群和猪舍有害气体的影响，2021)和张孝富等人(益生菌制剂对仔猪生长性能、养分消化率及有毒气体排放的影响，2020)指出益生菌可提高仔猪生长性能改善圈舍空气环境，降低
大肠杆菌数量。但目前尚没用益生菌制剂提高犬狂犬病病毒抗体水平的报道。而现有的植物乳杆菌只在水产养殖中用于净化水质；分解塘底有机物，除臭，消除藻类毒素，降解水体氨氮，改良水质；维持澡相，菌相平衡，降低稳定水体ph值；巴氏毕赤酵母更是在动物营养免疫领域鲜有应用。


技术实现要素：

6.发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种抑制病菌和/或提高免疫力和/或延长病毒抗体保护时间和/或减少排泄物臭气排放的植物乳杆菌(lactobacullus plantarum)y1或巴氏毕赤酵母(pichia pastoris)y2及其益生菌制剂。
7.本发明还要解决的技术问题是提供了所述植物乳杆菌(lactobacullus plantarum)y1或巴氏毕赤酵母(pichia pastoris)y2及其益生菌制剂的应用。
8.本发明还要解决的技术问题是提供了一种抑制病菌和/或提高免疫力和/或延长病毒抗体保护时间和/或减少排泄物臭气排放的药物。
9.技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
10.本发明提供了一株植物乳杆菌(lactobacullus plantarum)y1，所述植物乳杆菌(lactobacullus plantarum)y1的保藏日期为2022年6月10日，保藏于中国微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，保藏地址为：中国北京，保藏编号为cgmcc no.25041。
11.本发明还提供了一株巴氏毕赤酵母(pichia pastoris)y2，所述巴氏毕赤酵母(pichia pastoris)y2的保藏日期为2022年6月10日，保藏于中国微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，保藏地址为：中国北京，保藏编号为cgmcc no.25042。
12.本发明还提供了一种益生菌制剂，所述益生菌制剂含有所述的植物乳杆菌(lactobacullus plantarum)y1或所述的巴氏毕赤酵母(pichia pastoris)y2中的一种或几种。
13.其中，所述益生菌制剂包括液态制剂、粉末剂、胶囊剂、片剂中的一种或几种。
14.本发明还提供了所述的植物乳杆菌(lactobacullus plantarum)y1或所述的巴氏毕赤酵母(pichia pastoris)y2或所述的益生菌制剂在制备抑菌或杀菌剂和/或提高免疫力的药物和/或病毒抗体保护剂和/或减少排泄物臭气排放的药物中的应用。
15.其中，所述病菌包括a型产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌中的一种或几种。
16.其中，所述病毒抗体包括狂犬病病毒抗体。
17.本发明还提供了一种抑菌或杀菌剂，包括所述的植物乳杆菌(lactobacullus plantarum)y1和/或所述的巴氏毕赤酵母(pichia pastoris)y2或所述的益生菌制剂。
18.本发明还提供了一种提高免疫力的药物，包括所述的植物乳杆菌(lactobacullus plantarum)y1和/或所述的巴氏毕赤酵母(pichia pastoris)y2或所述的益生菌制剂。
19.本发明还提供了一种延长病毒抗体保护时间的药物，包括所述的植物乳杆菌(lactobacullus plantarum)y1和/或所述的巴氏毕赤酵母(pichia pastoris)y2或所述的益生菌制剂。
20.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
21.1、本发明首次获得了一种具有抑菌性、耐热性、良好的胃液耐受性、耐肠液性、可
提高犬免疫抗病力和降低犬排泄物臭气排放的植物乳杆菌(l.plantarum)y1和巴氏毕赤酵母(p.pastoris)y2。益生菌制剂作为绿色无污染添加剂，具有诸多功效。目前市场上，犬源益生菌目前多引自国外，效果褒贬不一。本发明通过同源分离获得了2株犬源益生菌植物乳杆菌(l.plantarum)y1和巴氏毕赤酵母(p.pastoris)y2，通过特定工艺，制成液体制剂，通过饮水添加，可有效提供犬免疫功能，提供狂犬病病毒抗体水平，且保护时间超过对照组，复合菌的效果优于单一菌。通过特定培养基和培养条件，研制成液体复合益生菌，操作简便易行。后开展临床饲喂试验，证实具有提高犬免疫功能和改善狂犬病毒疫苗抗体水平的功效，延长机体抵抗狂犬病毒的保护时间；同时植物乳杆菌和巴氏毕赤酵母能够在肠道内存活，利用肠道营养物质繁殖，从而抑制肠道腐败菌：产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的生长，减少犬排泄物中腐败菌数量，降低臭气产生。
22.2、分离获得犬来源的益生菌，开展菌株生理生化特性检测，研究益生菌所具有的益生效果，后开展临床中试，后推广出自主研发的益生菌产品，提高狂犬病疫苗对犬的保护作用，同时降低有害气体的排放。增强保护宠物犬健康，且为绿色生活环境添砖加瓦。
23.3、本发明表明通过给犬只添加l.plantarum y1，p.pastoris y2及复合益生菌可有效提高犬免疫功能，提高狂犬病病毒抗体水平和抗体保护时间；l.plantarum y1和p.pastoris y2还可有效抑制腐败菌：产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌；缓解犬粪便发酵后产生的氨气量，为国内首次报道。
附图说明
24.图1为经人工肠液处理后l.plantarum y1菌种的生长状况；
25.图2为经人工肠液处理后p.pastoris y2菌种的生长状况；
26.图3为狂犬病病毒抗体水平。
具体实施方式
27.下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
28.本发明从江苏省徐州地区健康田园犬品种的肠道内，分离多株益生菌，后经产消化酶评价、耐热评价、抑菌评价，得到2株益生菌，为植物乳杆菌、巴氏毕赤酵母菌，将2株益生菌申请中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心专利保藏，植物乳杆菌(lactobacullus plantarum y1，l.plantarum y1)于2022年6月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，保藏地址为：中国北京，保藏编号为cgmcc no.25041，巴氏毕赤酵母(pichia pastoris y2,p.pastoris y2)于2022年6月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，保藏地址为：中国北京，保藏编号为cgmcc no.25042。
29.实施例1益生菌菌种的益生特性评价
30.1、耐热评价
31.将l.plantarum y1和p.pastoris y2分别以2％的接种量分别接种于10ml mrs液体培养基中，分为5组，每组2ml，两种菌的活菌数量皆为109cfu/ml。置于25℃、60℃、80℃和100℃水浴锅中加热10min，再用pbs倍比稀释，涂板计数，每组重复3次。实验结果见表1。
32.表1
[0033][0034]
结果表明：p.pastoris y2可在80℃存活，且存活率较高，其耐热性能强于l.plantarum y1。饲料的制粒温度一般为79-80℃，故p.pastoris y2可在制粒温度下存活，可用于犬颗粒日粮的工业化生产。
[0035]
2、抑菌评价
[0036]
选取病原菌：a型产气荚膜梭菌(保藏编号为cvcc2030)、金黄色葡萄球菌(保藏编号为cvcc4265)和铜绿假单胞菌(保藏编号为cvcc3360)，分别购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。
[0037]
将划线活化后的l.plantarum y1和p.pastoris y2分别接种于mrs肉汤中，活化培养2代；之后于37℃培养16h，并调至菌体浓度为108cfu/ml。将a型产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌分别接入普通肉汤培养基中，37℃培养24h。分别取上述病原菌液100μl于营养琼脂平板上，涂抹均匀，平板上水平放置牛津杯，在牛津杯中分别加入200μl的l.plantarum y1和p.pastoris y2发酵菌液，每个平板内等距离放置3个牛津杯作为重复，于4℃放置2h后，37℃培养24h，测量抑菌圈直径并取平均值。实验结果见表2所示。
[0038]
表2
[0039][0040]
结果表明：p.pastoris y2和l.plantarum y1对a型产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌皆具有的抑菌作用。p.pastoris y2较l.plantarum y1对a型产气荚膜梭菌和铜绿假单胞菌的抑菌活性更强。故l.plantarum y1和p.pastoris y2可联合用于益生菌制剂的研发。
[0041]
实施例2人工胃液、肠液耐受性测试
[0042]
按比例在装有100ml生理盐水的试管中添加稀盐酸调节ph，使ph值分别为2.0、3.0和4.0，高压锅灭菌，待高压锅冷却后每管加入胃蛋白酶，配成1％胃蛋白酶溶液，摇匀，模拟犬的胃生理环境。分别将活化的两种菌种(l.plantarum y1活菌数为107cfu/ml，p.pastoris y2活菌数为108cfu/ml)以1％的体积分数接种至上述试管中。放入培养箱培养4h后，用接种环在mrs固体培养基(称取葡萄糖20g，牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，磷酸二氢钾2g，三水合乙酸钠5g，柠檬酸三胺2g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，溶于1000ml蒸馏
水，加入琼脂粉10g，灭菌后，冷却成固态琼脂培养基)培养，放入培养箱12h后观察结果并分析。
[0043]
表3
[0044][0045]
如表3所示，l.plantarum y1和p.pastoris y2经不同ph浓度的人工胃液处理后菌种生长情况，由结果可知，随着ph浓度的升高，l.plantarum y1和p.pastoris y2活菌数量随之升高。动物体内胃液ph通常维持在0.9-1.8之间，随着动物采食后，食物进入胃后，与胃液混合后，食靡的ph约2.3-4.2之间，因此两菌种虽食物进入胃后，能忍受犬的胃生理酸碱度，具有良好的胃液耐受性。
[0046]
2、人工肠液耐受性试验
[0047]
在100ml生理盐水中加入0.68g磷酸二氢钾，再加入0.4％氢氧化钠使ph达到6.8，高压锅灭菌，待高压锅冷却后每管加入胰蛋白酶，配成1％胰蛋白酶溶液，摇匀，模拟犬的小肠生理环境。分别将活化的两种菌种以1％的体积分数接种至上述试管中，此时两种菌的活菌数量均为108cfu/ml。放入培养箱培养4h后，用接种环在mrs固体培养基培养，放入培养箱12h后观察结果并分析。
[0048]
如图1和图2所示，l.plantarum y1的活菌数量为(1.08
±
0.05)
×
108cfu/ml，p.pastoris y2的活菌数量为(1.12
±
0.04)
×
108cfu/ml，两种菌的活菌数量均没有明显减少。l.plantarum y1和p.pastoris y2两菌种在经过人工肠液处理后接种在培养基上仍能存活并定植，具有良好的耐肠液性。
[0049]
实施例3液态复合益生菌制剂的生产
[0050]
1)菌种
[0051]
选择中国微生物菌种保藏管理中心专利保藏的植物乳杆菌cgmcc no.25041(lactobacullus plantarum y1，l.plantarum y1)，巴氏毕赤酵母cgmcc no.25042(pichia pastoris y2,p.pastoris y2)。
[0052]
2)菌种的活化与种子液的获得
[0053]
将保存在4℃的液态菌l.plantarum y1和p.pastoris y2，分别按1％接种量，接种于mrs液体培养基上，37℃培养12h，如此连续活化2次后，得到两种菌种子液。
[0054]
3)生产
[0055]
配制特定培养基，其组分及百分含量：饲料级糖蜜10％，尿素8％，饲料级维生素
e1％，其他为水。搅拌混合均匀后，置于100l发酵罐高压灭菌，冷却至室温；按体积比3％接种l.plantarum y1和p.pastoris y2种子液，培养20h，后收集液态菌液，即得液态复合益生菌制剂。放于4℃冰箱中，备用。
[0056]
单独制备l.plantarum y1和p.pastoris y2液态益生菌制剂，培养基组分同上，按体积比5％接种l.plantarum y1或p.pastoris y2种子液，培养20h，后收集l.plantarum y1液态菌液和p.pastoris y2液态菌液。
[0057]
4)产品活菌数
[0058]
用选择性计数培养基，采用平板计数法，检测发酵液中l.plantarum y1和p.pastoris y2的活菌数量，达到7.0x109活菌单位每毫升(cfu/ml)。
[0059]
5)货架时间
[0060]
将密封好的益生菌制剂放在室温下保存，分别于90天后，按上步方法，检测其中l.plantarum y1和p.pastoris y2活菌数量。结果表明：90天后，l.plantarum y1和p.pastoris y2活菌数量均为5.8x108cfu/ml，均超过国家饲用微生态添加剂活菌含量要求(》107cfu/g)。
[0061]
实施例4益生菌对犬的免疫效果评估
[0062]
1)动物及分组
[0063]
选用年龄在4月的幼犬30只，均只做过一次免疫(不包含狂犬疫苗)，根据体重和窝进行分组，分为益生菌l.plantarum y1组(n＝10)，益生菌p.pastoris y2组(n＝10)复合益生菌组含l.plantarum y1和p.pastoris y2，空白对照组(n＝10)。幼犬编号第一个为窝编号，第二个为窝内编号。按宠物犬日常进行饲养管理，饲粮为幼犬全价饲粮，由上海信元宠物食品有限公司提供。
[0064]
试验分两个阶段：第一阶段3组益生菌组分别饲喂l.plantarum y1益生菌菌液、p.pastoris y2益生菌菌液和复合益生菌菌液(服用量为0.8ml/每公斤体重)，直接灌服，一天一次；将30只犬按照常规饲养条件进行饲养，保证食物充足，分笼饲养，同一饲养条件下饲养，连续饲喂14d。第二阶段，采用第一阶段的饲喂方法继续饲喂，并按表4中的疫苗接种安排进行相应免疫程序。
[0065]
表4
[0066][0067]
疫苗为捌：犬瘟热、腺病毒2型、副流感、细小病毒病四联活疫苗-犬钩端螺旋体病(犬型、黄疸出血型)二价灭活疫苗-犬冠状病毒灭活疫苗。生产企业为硕腾公司美国林肯厂。瑞比克：狂犬病灭活疫苗，生产商为美国礼来公司美国生产厂。
[0068]
3)抗体水平
[0069]
在试验阶段的0d、15d、54d、70d、84d，采集犬血样，3000rpm/min离心收集血清，-20℃保存备测。严格按照说明书步骤进行操作，使用elisa试剂盒定量检测血清免疫球蛋白a
(iga)和狂犬病病毒(rv)抗体，iga和rv的elisa试剂盒分别购自江苏晶美生物科技有限公司、北京金诺百泰生物技术有限公司。所有数据均以平均数
±
标准差表示，用spss17.0软件进行统计分析。差异显著者进行duncan氏进行多重比较，以p《0.05作为差异显著性判断标准。
[0070]
表5
[0071][0072]
幼犬iga的检测结果如表5所示，在0d时，三组益生菌组与对照组的iga含量相比，无显著差异(p》0.05)。在15d时，三组益生菌组免疫球蛋白含量较对照组提高了28.06％，差异显著(p《0.05)；在54d时，三组益生菌添加组犬血清中iga含量提高了13.69％，与对照组相比差异显著(p《0.05)；于试验后70d、84d分别检测，以复合益生菌益生菌组的iga水平最高，分别较对照组提高了40.91％(p≤0.01)、37.59％(p《0.01)，差异极显著(p《0.01)。从整体的趋势上看，三组益生菌组较于对照组始终保持正差值，且差值相较于整体比例具有一定意义。综合来看，益生菌制剂可以显著提高iga在幼犬体内的含量并且减缓iga下降速度。
[0073]
在试验阶段的0d、56d、70d、84d、98d，采集犬血样，3000rpm/min离心收集血清，-20℃保存备测。严格按照说明书步骤进行操作，使用elisa试剂盒定量检测幼犬血清中rv抗体。通过梯度稀释标准品的浓度和其od差值(od差值＝od450nm-od620nm)计算标准曲线和r2(r2≥0.95)。在定性检测中，根据判定标准，判定幼犬免疫是否成功(表6)。
[0074]
表6
[0075][0076]
在0d(未注射狂犬疫苗)和56d(完成三次免疫的第0天)血清中未检测到rv抗体；在试验70d(完成三次免疫的第14天)，益生菌组和对照组的幼犬血清中均检测出rv抗体，两组之间抗体水平没有显著性差异(p》0.05)，如图3所示。在第84d的检测中，三组益生菌添组的rv抗体的滴度较对照组提高了89.12％，91.26％和96.39％，差异极显著(p《0.01)。在定性检测中，在第70d时，l.plantarum y1组出现4例弱阳性，6例阳性，阳性率为60％，弱阳性为40％，阴性率为0％。p.pastoris y2组出现3例弱阳性，其余均阳性，阳性率为70％，弱阳性为30％，阴性率为0％。复合益生菌组阳性率为75％，弱阳性为25％，阴性率为0％。对照组出现2例阴性，其余均阳性，其阳性率为75％，弱阳性为0％，阴性率为25％；在第84d，三组益生菌组和对照组的全部幼犬均为阳性；至第96天，三组益生菌添加组犬血清rv水平仍为阳性，抗体水平极显著高于对照组(p《0.01)；对照组3例阳性、4例弱阳性、3例阴性。且复合益生菌显著高于l.plantarum y1组和p.pastoris y2组，差异极显著(p《0.01)。结果表明：本发明
的益生菌制剂可大幅提高幼犬的rv抗体水平(p《0.01)，在一定程度上降低幼犬免疫失败的概率，且延长抗体保护时间，复合益生菌组效果优于单一添加组(l.plantarum y1组和p.pastoris y2组)。
[0077]
4)氨气含量
[0078]
从试验第28d开始，每14d收集犬粪便，每只犬单独收粪，剔除杂物，准确称取20g粪便，装入200ml棕色玻璃瓶中，用硅胶塞密封，室温下放置发酵3d。后用注射器抽取50ml发酵气体，经大气采样器，用气测定管(日本光明理化株式会社生产)测定氨气含量。所有数据均以平均数
±
标准差表示，用spss17.0软件进行统计分析。差异显著者进行duncan氏进行多重比较，以p《0.05作为差异显著性判断标准。
[0079]
表7
[0080][0081]
结果见表7：在28天内，三个益生菌添加组的犬排泄物中发酵所产生的氨气量低于对照组，l.plantarum y1与p.pastoris y2组之间，无显著差异(p》0.01)。复合益生菌组低于对照组约8.89mg/l(p《0.01)，于试验第42d、56d、70d和84d收集的犬排泄物发酵后所产生的氨气含量，三个益生菌组均极显著低于对照组(p《0.01)，56d、70d和84d，p.pastoris y2组极显著低于l.plantarum y1组(p《0.01)，复合益生菌组最低(p《0.01)。
[0082]
综上，本发明的益生菌制剂含有的2种益生菌l.plantarum y1和p.pastoris y2皆具有抑制腐败菌：产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的能力；能够耐受胃肠道内环境，在肠道内存活，从而繁殖；可有效抑制腐败菌生长繁殖，降低粪便中腐败菌数量，减少粪便发酵产生的氨气量，减少臭味。