本发明属于生物工程，尤其涉及一种解淀粉芽孢杆菌工程菌及其构建方法与其在调控产不同分子量聚谷氨酸中的应用。
背景技术：
1、γ-聚谷氨酸(γ-pga)是一种天然生物聚合物，由l-和/或d-谷氨酸单元的γ酰胺键组成，分子量从500到3000kda不等。γ-pga作为一种谷氨酸聚合物，分子量是影响其生物学性能的重要参数，不同的用途对γ-pga分子量的需求不同。近年来研究报道，高分子量γ-pga要参与絮凝(3000kda)，去除重金属和染料(2500kda)，和组织工程支架(2000kda)。低分子量γ-pga被认为特别适用于作物冷冻保护剂(2kda)，益生菌保护剂(257kda)，和药物载体(45-60kda)。
2、为了生产特定分子量的γ-pga，生物酶促降解法受到了相当大的关注。研究表明，由地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌分泌到培养基中的聚谷氨酸水解酶pgds具有将高分子量γ-pga切割成1000da到20kda片段的能力。此外，通过在地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)wx-02中过表达pgds实现了特定γ-pga的一步合成，导致γ-pga的分子量从1000-1200kda降低到600-800kda。同样，在解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)中过表达pgds，有效地将γ-pga的分子量降低到20-30kda。总之，这些表明酶法降解是获得具有不同分子量的γ-pga的有效方法。
3、尽管如此，然而为了实现对降解酶表达水平特定调控，需要构建大量的基因表达文库，消耗人力资源，并且造成了生产工艺的复杂性，不适用于大规模工业化生产。相比之下，创建具有可变分子量的γ-pga合成的水解酶表达水平可调的有效细胞工厂是一个更加理想的选择。为了获得具有多元分子量的γ-pga，应在动态范围内微调pgds表达水平。目前，诱导型启动子系统是最流行的通过添加特定诱导分子来外部动态控制基因表达的工具之一。然而，它们通常具有相对较窄的诱导范围，限制了它们在基因表达调节中的适用性。近年来，已经建立了聚集规则间隔短回文重复干扰(crispri)系统来调节基因的表达。已证明大肠杆菌基因组内可预测的分级宽动态范围基因表达(10至300倍抑制)。通过这种方法，在一个微生物底盘中动态控制pgds的表达水平以生产具有不同分子量的γ-pga将是实用且有效的。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种解淀粉芽孢杆菌工程菌。
2、本发明还要解决的技术问题是上述解淀粉芽孢杆菌工程菌的构建方法。
3、本发明最后要解决的技术问题是上述解淀粉芽孢杆菌工程菌在调控产不同分子量聚谷氨酸中的应用。
4、为了解决上述技术问题，本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌工程菌，可动态调节聚谷氨酸降解酶表达水平并用于生产多元分子量聚谷氨酸。
5、本发明还公开了上述解淀粉芽孢杆菌工程菌的构建方法。
6、本发明最后公开了上述解淀粉芽孢杆菌工程菌在调控产不同分子量聚谷氨酸中的应用。
7、一种解淀粉芽孢杆菌工程菌，它是包含了双质粒表达系统的解淀粉芽孢杆菌，所述的双质粒crispr-dcas9表达系统表达dcas9蛋白模块和sgrna靶向调控模块；
8、其中，所述的dcas9蛋白模块包括启动子pgrac、dcas9蛋白基因dcas9和淀粉酶终止子tamy，其连接方式为三者顺次连接pgrac-dcas9-tamy；
9、其中，所述的sgrna靶向调控模块包括3个sgrna片段sgrna1、sgrna2和sgrna3，1个聚谷氨酸降解酶基因pgds，4个启动子phpaⅱ、pbad、pglv和pxyl，2个淀粉酶终止子tamy，其连接方式为phpaⅱ-pgds-tamy-pbad-sgrna1-pglv-sgrna2-pxyl-sgrna3-tamy。
10、其中，所述的解淀粉芽孢杆菌工程菌是以解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciens ns为宿主菌。
11、具体的，所述的解淀粉芽孢杆菌bacillus amyloliquefaciens ns是由解淀粉芽孢杆菌bacillus amyloliquefaciens nb敲除内源聚谷氨酸降解酶pgds基因pgds1和dl-肽链内切酶cwlo基因cwlo后得到；所述的解淀粉芽孢杆菌bacillus amyloliquefaciens nb是由解淀粉芽孢杆菌nx-2s(cctcc no:m 2016346)消除内源质粒p2sip得到。(解淀粉芽孢杆菌bacillus amyloliquefaciens nb的构建方法已公开在专利cn 108624546 a中，解淀粉芽孢杆菌nx-2s的详细信息已公开在专利cn 106047780 a中)
12、具体的，解淀粉芽孢杆菌bacillus amyloliquefaciens nb敲除内源聚谷氨酸降解酶pgds基因pgds1和dl-肽链内切酶cwlo基因cwlo构建解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciens ns的方法如下：以解淀粉芽孢杆菌基因组为模板，利用引物将目的基因pgds1上下游各800bp同源臂扩增出来。同时，以表达质粒pma5为模板扩增组成型强启动子phpaⅱ。胶回收后将启动子及上下游同源臂通过重叠pcr融合成片段phpaⅱ-pgdsup-pgdsdn，再利用一步克隆法将融合片段克隆至ecor i和xho i双酶切的载体pdr-phes*，得到重组质粒pdr-phes*-pgds。将验证正确的重组质粒经过去甲基化后，电转化(电压2.5-2.9kv，电击时间4ms)至解淀粉芽孢杆菌nb中，将含有重组质粒的菌株在30℃下含有100μg/ml壮观霉素的lb平板培养基中培养12h后，转接至42℃下含有100μg/ml壮观霉素抗性的lb培养液中培养24-48h诱导质粒发生单交换。将单交换阳性克隆子在无抗性的lb培养液培养2代后，稀释涂布于含有5mm底物p-cl-phe的lb底物平板培养基上，得到pgds1敲除菌株nb(△pgds)。将目的基因改为cwlo，重复上述操作，最终得到pgds1和cwlo双敲除的解淀粉芽孢杆菌bacillus amyloliquefaciens ns。
13、具体的，所述的内源聚谷氨酸降解酶pgds基因pgds1的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述的dl-肽链内切酶cwlo基因cwlo的核苷酸序列如seq id no.2所示。
14、其中，所述的双质粒表达系统包括pnx01质粒和phy300plk质粒，pnx01质粒用于表达dcas9蛋白模块，phy300plk质粒用于表达sgrna靶向调控模块。
15、具体的，所述的dcas9蛋白模块中，启动子pgrac的核苷酸序列如seq id no.4所示，淀粉酶终止子tamy的核苷酸序列如seq id no.5所示；dcas9蛋白的氨基酸序列如seq idno.27所示，编码dcas9蛋白的核苷酸序列如seq id no.26所示。
16、具体的，所述的sgrna靶向调控模块中，3个sgrna片段来源于sg1、sg2、sg3、sg4、sg5、sg6、sg7、sg8、sg9、sg10、sg11、sg12中的任意3条；其中，sg1的核苷酸序列如seq idno.7，sg2的核苷酸序列如seq id no.8，sg3的核苷酸序列如seq id no.9，sg4的核苷酸序列如seq id no.10，sg5的核苷酸序列如seq id no.11，sg6的核苷酸序列如seq id no.12，sg7的核苷酸序列如seq id no.13，sg8的核苷酸序列如seq id no.14，sg9的核苷酸序列如seq id no.15，sg10的核苷酸序列如seq id no.16，sg11的核苷酸序列如seq id no.17，sg12的核苷酸序列如seq id no.18。
17、具体的，所述的sgrna靶向调控模块中，聚谷氨酸降解酶基因pgds的核苷酸序列如seq id no.6所示，启动子phpaⅱ的核苷酸序列如seq id no.3，启动子pbad的核苷酸序列如seq id no.19，启动子pglv的核苷酸序列如seq id no.20所示；pxyl启动子的核苷酸序列如seq id no.21所示；淀粉酶终止子tamy的核苷酸序列如seq id no.5所示。
18、其中，所述的解淀粉芽孢杆菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：
19、(1)构建dcas9蛋白表达质粒：
20、(1a)以质粒pdcas9-bacteria为模板通过pcr扩增得到dcas9片段，以枯草芽孢杆菌bacillus subtilis表达质粒pht01为模板扩增得到启动子pgrac，以解淀粉芽孢杆菌nx-2s的基因组为模板扩增得到淀粉酶终止子tamy，通过胶回收试剂盒对pgrac、dcas9和tamy片段进行回收后，采用重叠pcr对三个片段融合得到dcas9蛋白模块pgrac-dcas9-tamy。
21、(1b)采用一步克隆通过sma i和xba i酶切将步骤(1a)得到的dcas9蛋白模块pgrac-dcas9-tamy连接至质粒pnx01上，得到重组质粒pnx-dcas9。
22、(2)构建sgrna靶向调控降解酶表达质粒：
23、(2a)以枯草芽孢杆菌nx-2的基因组为模板扩增得到聚谷氨酸降解酶基因pgds，以质粒pma5为模板扩增得到启动子phpaⅱ，通过胶回收试剂盒对pgds、phpaⅱ片段进行回收后，采用重叠pcr对启动子phpaⅱ、聚谷氨酸降解酶基因pgds和步骤(1a)已扩增回收得到的淀粉酶终止子tamy融合得到phpaⅱ-pgds-tamy片段。
24、(2b)根据启动子phpaii片段和聚谷氨酸降解酶基因pgds基因的序列利用grnafinder分别在启动子区-35区、rbs区的+30位置、基因片段非模板链的+150位置、+400位置、+700位置、+1000位置及+1150位置、基因片段模板链的+130位置、+200位置、+600位置、+1000位置及+1100位置，选取20bp作为靶向序列，利用对应的引物pcr分别融合进tracrna骨架组成sg1、sg2、sg3、sg4、sg5、sg6、sg7、sg8、sg9、sg10、sg11、sg12，选择其中的任意3条作为sgrna1、sgrna2和sgrna3；以枯草芽孢杆菌bacillus subtilis 168基因组为模板通过pcr扩增得到启动子pbad和启动子pxyl，以质粒pkd46为模板通过pcr扩增得到启动子pglv。将sgrna1、sgrna2、sgrna3、启动子pbad、启动子pxyl和启动子pglv融合得到pbad-sgrna1-pglv-sgrna2-pxyl-sgrna3片段，在将融合得到的pbad-sgrna1-pglv-sgrna2-pxyl-sgrna3片段与淀粉酶终止子tamy融合得到pbad-sgrna1-pglv-sgrna2-pxyl-sgrna3-tamy片段。
25、优选的，3条sgrna1、sgrna2和sgrna3片段分别为sg4、sg5和sg6。
26、优选的，将sg4、sg5、sg6、启动子pbad、启动子pxyl和启动子pglv融合得到pbad-sg4-pglv-sg5-pxyl-sg6片段，在将融合得到的pbad-sg4-pglv-sg5-pxyl-sg6片段与淀粉酶终止子tamy融合得到pbad-sg4-pglv-sg5-pxyl-sg6-tamy片段。
27、(2c)将步骤(2b)得到的pbad-sgrna1-pglv-sgrna2-pxyl-sgrna3-tamy片段和步骤(2a)得到的phpaⅱ-pgds-tamy片段进一步融合，并通过ecor i和hind iii连接到质粒phy300plk中，得到重组质粒phy-ppp-pgds。
28、优选的，将pbad-sg4-pglv-sg5-pxyl-sg6-tamy片段和phpaⅱ-pgds-tamy片段进一步融合，并通过ecor i和hind iii连接到质粒phy300plk中，得到重组质粒phy-ppp-pgds。
29、(3)构建解淀粉芽孢杆菌工程菌nsd9-ppp：
30、将步骤(1b)构建得到的重组质粒pnx-dcas9转化至大肠杆菌e.coli gm2163中进行去甲基化dam-、dcm-，再将去甲基化的重组质粒pn0x01-pgds转化至宿主菌bacillusamyloliquefaciens ns中，得到重组菌株nsd9。将步骤(2c)得到的重组质粒phy-ppp-pgds转化至重组菌株nsd9中，构建得到解淀粉芽孢杆菌工程菌nsd9-ppp。
31、所述的解淀粉芽孢杆菌工程菌在调控产不同分子量聚谷氨酸中的应用也在本发明所保护的范围之内。
32、其中，所述的调控产不同分子量聚谷氨酸，其所用的发酵培养基为：菊粉粗提液30-80g/l，硫酸铵1-10g/l，三水合磷酸氢二钾5-30g/l，磷酸二氢钾0.1-10g/l，无水硫酸镁0.1-5g/l，一水硫酸锰0.01-0.1g/l。
33、其中，将重组菌株nsd9在30-40℃发酵培养第0-24h时，添加0.1-1mm iptg诱导dcas9蛋白的表达。
34、优选的，将重组菌株nsd9在32℃发酵培养第8h时，添加0.5mm iptg诱导dcas9蛋白的表达。
35、其中，通过控制木糖、麦芽糖和阿拉伯糖的浓度和添加时间控制聚谷氨酸降解酶基因pgds的表达量，从而获取不同分子量范围的γ-pga。
36、具体的，通过在28-35℃发酵培养0-24h后添加5-15g/l的木糖、5-15g/l麦芽糖和0.02-2g/l阿拉伯糖中的任意一种或几种的组合，动态调控降解酶pgds的水解活性，继续在28-35℃发酵培养48-100h；控制聚谷氨酸降解酶基因pgds的表达量，获取不同分子量范围的γ-pga。
37、优选的，在32℃，发酵培养8h后添加5-15g/l的木糖、5-15g/l麦芽糖和0.02-2g/l阿拉伯糖，继续发酵培养88h时，
38、(1)①当添加木糖浓度0≤c木糖≤5g/l时，γ-pga的分子量范围大约为50kda≤mw≤390kda；②当添加木糖浓度5＜c木糖≤10g/l时，γ-pga的分子量范围大约为400kda＜mw≤500kda；③当添加木糖浓度10＜c木糖≤15g/l时，γ-pga的分子量范围大约为500kda＜mw≤560kda。
39、(2)①当添加麦芽糖浓度0≤c麦芽糖≤5g/l时，γ-pga的分子量范围大约为50kda≤mw≤360kda；②当添加麦芽糖浓度5＜c麦芽糖≤10g/l时，γ-pga的分子量范围大约为360kda＜mw≤400kda；③当添加麦芽糖浓度10＜c麦芽糖≤15g/l时，γ-pga的分子量范围大约为400kda＜mw≤500kda。
40、(3)①当添加阿拉伯糖浓度0≤c木糖≤5g/l时，γ-pga的分子量范围大约为50kda≤mw≤280kda；②当添加阿拉伯糖浓度5＜c阿拉伯糖≤10g/l时，γ-pga的分子量范围大约为280kda＜mw≤360kda；③当添加阿拉伯糖浓度10＜c阿拉伯糖≤15g/l时，γ-pga的分子量范围大约为360kda＜mw≤420kda。
41、(4)①当添加15g/l木糖和2g/l阿拉伯糖时，γ-pga的分子量约为800kda；②当添加15g/l木糖、15g/l麦芽糖和2g/l阿拉伯糖时，γ-pga的分子量约为1000kda；③当添加15g/l木糖和15g/l麦芽糖时，γ-pga的分子量约为1400kda。
42、其中，所述聚谷氨酸γ-pga经分离纯化后，可用于农业、食品、医药、化妆品和临床等方面。
43、有益效果：
44、1、本发明所提供的利用工程菌调控合成不同分子聚谷氨酸的方法中，转化底物为价格低廉的菊粉粗提液，大大节约了生产成本，适用于工业化生产。
45、2、本发明提供了一种构建动态调控基因线路的方法，具有发酵过程理性调控聚谷氨酸分子量大小的优势和外源添加诱导剂的时空特异性。
46、3、通过构建γ-pga生产工程菌株和引入动态调控基因线路，在发酵培养基中可以积累24-27g/l分子量范围为50-1400kda的γ-pga，具有较好的应用前景。基于应用分析，本发明的方法对于工业化生产不同聚谷氨酸具有巨大的经济和社会效益。
47、4、本发明调控生产的聚谷氨酸具有更为均一的分子量范围，面向的应用领域更加精确。