一种防治黄瓜花叶病毒的疫苗及其制备方法

本发明属于植物病害防治，具体涉及一种防治黄瓜花叶病毒的疫苗及其制备方法。

背景技术：

1、由植物病毒引起的病害素有“植物癌症”之称，其造成的经济损失非常严重。黄瓜花叶病毒（ cucumber mosaic virus, cmv）是一种非常严重的病毒病害，病毒可以到达除生长点以外的任何部位。黄瓜花叶病毒是寄主范围最多、分布最广、最具经济重要性的植物病毒之一。黄瓜花叶病毒是三分体正义单链rna病毒，rna1含有1个orf，编码1a复制酶蛋白；rna2含有2个orf，5'端编码2a复制酶蛋白，3'端编码2b蛋白。前人研究发现植物受黄瓜花叶病毒侵染后的症状表现是由1a和2a复制酶蛋白共同决定的，二者具有协同作用；rna3也有2个orf，5'端编码31kda的胞间运动蛋白（mp），3'端编码一个24-26kda的外壳蛋白（cp）。

2、目前，在生产上防治黄瓜花叶病毒病通常以化学防治为主，但易造成药剂残留和环境污染等问题。培育抗病品种也是防治黄瓜花叶病的有效方式之一，但育种工作进展缓慢，而生物防治技术已经逐渐成为病害防治的新方法。

3、病毒诱导基因沉默（virus-induced gene silence，vigs）是一种对植物进行反向遗传操作的技术，是植物防御机制的表现。农杆菌介导的vigs技术通过农杆菌将携带目的基因片段的病毒载体转移到植物细胞中，介导靶向同源基因的mrna降解，引起目的基因沉默。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明构建靶向相关基因片段的烟草脆裂病毒trv载体并转化农杆菌感受态细胞，为随后的trv介导的防治黄瓜花叶病毒的vigs体系的建立奠定基础。

2、为解决以上技术问题，本发明通过以下技术方案实现：

3、一种防治黄瓜花叶病毒的疫苗，包括ptrv1和至少一种重组表达载体ptrv2-目标基因，所述目标基因为cmv-1a、cmv-2a、cmv-mp或cmv-cp，序列分别如seq id no.1、seq idno.2、seq id no.3和seq id no.4所示。

4、优选的，所述疫苗包括ptrv1和四种重组表达载体ptrv2-目标基因，所述目标基因分别为cmv-1a、cmv-2a、cmv-mp和cmv-cp，序列分别如seq id no.1、seq id no.2、 seq idno.3和seq id no.4所示。

5、其中，所述重组表达载体ptrv2-目标基因由以下步骤构建：

6、（1）提取感染了黄瓜花叶病毒的烟株叶片的总rna，将其反转成cdna；

7、（2）再以所述cdna为模板进行pcr 扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段；

8、（3）对ptrv2空载体质粒进行 ecori/ bamhi双酶切，回收酶切产物之后，获得线性化载体；

9、（4）将步骤（2）所得扩增产物目的片段与步骤（3）所得线性化载体进行连接，随后转化至大肠杆菌 dh5α感受态细胞，（将测序正确的单克隆菌株）扩繁并提取质粒。

10、优选的，关于步骤（2）pcr 扩增中对应的引物：当目标基因为cmv-1a时，引物对为seq id no.5和seq id no.6；当目标基因为cmv-2a时，引物对为seq id no.7和seq idno.8；当目标基因为cmv-mp时，引物对为seq id no.9和seq id no.10；当目标基因为cmv-cp时，引物对为seq id no.11和seq id no.12。

11、上述疫苗的制备方法，包括以下步骤：

12、（1）将所述重组表达载体ptrv2-目标基因转化农杆菌gv3101感受态细胞，得到原始菌液；将原始菌液均匀涂抹在lb（含有浓度为20-30mg/ml利福平和40-60mg/ml卡那霉素）固体培养基上，25-30℃下倒置培养40-50h，挑取单菌落经pcr扩增后，使用琼脂糖凝胶电泳检测验证，将验证正确的原始菌液扩繁后保存至超低温冰箱备用；

13、（2）将trv1菌液和每种trv2初始菌液分别接种到lb液体培养基上，25-30℃、150-250r/min过夜培养后，调整浓度为od600≈0.8～1.0，然后将所培养的trv1菌液分别和所培养的单种trv2菌液混合摇匀，体积比为1：（0.8-1.2），之后再都混合在一起冻干，即得到防治黄瓜花叶病毒的疫苗。

14、上述疫苗的使用方法，包括以下步骤：在所述疫苗中加入缓冲液对其进行活化，混合均匀；所述缓冲液与所述疫苗的体积比为1：（0.8-1.2）；在室温下遮光存放，将所得混合液按1：（8-12）兑水，然后将其均匀地喷洒到剪叶的烟苗上，喷洒量为叶面有肉眼可见的水珠即可。

15、本发明具有以下积极有益效果：

16、本发明能够有效沉默外源侵入的黄瓜花叶病毒基因的表达，基因沉默效率最高达60.4%，有效的抑制了黄瓜花叶病毒在植株体内的传播，发病时间推迟。

技术特征：

1. 一种防治黄瓜花叶病毒的疫苗，其特征在于：包括ptrv1和至少一种重组表达载体ptrv2-目标基因，所述目标基因为cmv-1a、cmv-2a、cmv-mp或cmv-cp，序列分别如seq idno.1、seq id no.2、seq id no.3和seq id no.4所示。

2. 根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗包括ptrv1和四种重组表达载体ptrv2-目标基因，所述目标基因分别为cmv-1a、cmv-2a、cmv-mp和cmv-cp，序列分别如seqid no.1、seq id no.2、seq id no.3和seq id no.4所示。

3.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述重组表达载体ptrv2-目标基因由以下步骤构建：

4. 根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：关于步骤（2）pcr 扩增中对应的引物：当目标基因为cmv-1a时，引物对为seq id no.5和seq id no.6；当目标基因为cmv-2a时，引物对为seq id no.7和seq id no.8；当目标基因为cmv-mp时，引物对为seq id no.9和seq idno.10；当目标基因为cmv-cp时，引物对为seq id no.11和seq id no.12。

5.权利要求1-4任一项所述疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述lb固体培养基含有浓度为20-30mg/ml利福平和40-60mg/ml卡那霉素。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤（二）混合摇匀所用培养的trv1菌液和单种原始trv2菌液混合的体积比为1：（0.8-1.2）。

8.权利要求1-4任一项所述疫苗的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：在烟草上使用时，在所述疫苗中加入缓冲液对其进行活化，混合均匀；在室温下遮光存放，将所得混合液兑水，然后将其均匀地喷洒到剪叶的烟苗上，喷洒量为叶面有肉眼可见的水珠即可。

9.根据权利要求8所述的使用方法，其特征在于：所述缓冲液与所述疫苗的体积比为1：（0.8-1.2）。

10.根据权利要求8所述的使用方法，其特征在于：所述混合液按体积比1：（8-12）兑水。

技术总结
本发明属于植物病害防治技术领域，具体涉及一种防治黄瓜花叶病毒（CMV）的疫苗，包括pTRV1和四种重组表达载体pTRV2‑目标基因，所述目标基因分别为CMV‑1a、CMV‑2a、CMV‑MP和CMV‑CP，序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。在烟草上使用时，先在所述疫苗中加入缓冲液对其进行活化，混合均匀；在室温下遮光存放，将所得混合液兑水，然后将其均匀地喷洒到剪叶的烟苗上，喷洒量为叶面有肉眼可见的水珠即可。本发明能够有效沉默外源侵入的黄瓜花叶病毒基因的表达，基因沉默效率最高达60.4%，有效的抑制了黄瓜花叶病毒在植株体内的传播，发病时间推迟。

技术研发人员：杨铁钊,周方,周健飞,何冰,武兆云,徐世晓,孙聚涛,李俊营,郭玉鸽
受保护的技术使用者：河南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15