一种真菌细菌四联核酸检测试剂盒及其检测方法和应用与流程

1.本发明涉及一种真菌细菌四联核酸检测试剂盒及其检测方法和应用，属于基因检测领域。


背景技术：

2.外阴阴道念珠菌病是一种妇科常见疾病，白色念珠菌是常见的致病菌，约75％的女性终生会患病一次，且有50％左右的复发感染几率.阴道毛滴虫引发的患者阴道炎发病，是一种十分常见的性传播疾病，在世界范围内均有分布流行。阴道毛滴虫也是诱发人体泌尿生殖系统感染的常见病原体，由于是通常寄生在女性阴道和泌尿道的厌氧性寄生虫，常可引发女性阴道炎和尿道炎，也成为了hiv感染和诱发宫颈癌的主要危险因素。研究表明，发生宫颈病变的患者阴道乳酸杆菌的含量明显降低，并且乳酸杆菌具有对宫颈癌细胞的细胞毒作用，乳酸杆菌的失调，带来了极大的宫颈疾病发生的风险，巨球菌等阴道微生物的组成增加，会导致乳酸杆菌的失调，从而引起多种宫颈及阴道疾病。目前对真菌，细菌等相关感染诊断大多是通过抗血清学方法检测，但是其存在灵敏度低，假阳性高等缺点。近年来运用荧光pcr技术对真菌进行检测的种类越来越多，通过对真菌的特异的靶序列设计taqman探针及引物，能够在很大程度上保证检测结果的特异性。然而现有的试剂盒在针对白色念珠菌、阴道毛滴虫、乳酸杆菌以及马氏巨球菌检测时，均采取单独检测的方式，只能在一个反应管中检测一种病毒或真菌，并且现有的试剂盒大多存在特异性差，灵敏性低、通量小等缺陷，有待改进。


技术实现要素：

3.本发明的主要目的是提供一种真菌细菌四联核酸检测试剂盒，旨在解决上述技术问题。
4.为实现上述目的，本发明提出的一种真菌细菌四联核酸检测试剂盒包括如下组分：mix反应液1、mix反应液2、阳性对照以及阴性对照，所述mix反应液2包括一条检测白色念珠菌的第一探针、一条检测阴道毛滴虫的第二探针、一条检测乳酸杆菌的第三探针以及一条检测马氏巨球菌的第四探针。
5.在一实施例中，所述mix反应液2包括第一组分、第二组分、第三组分以及第四组分，所述第一组分包括一对检测白色念珠菌的第一引物和一条检测白色念珠菌的所述第一探针，所述第二组分包括一对检测阴道毛滴虫的第二引物和一条检测阴道毛滴虫的所述第二探针，所述第三组分包括一对检测乳酸杆菌的第三引物和一条乳酸杆菌的所述第三探针，所述第四组分包括一对检测马氏巨球菌的第四引物和一条马氏巨球菌的所述第四探针。
6.在一实施例中，所述序列表如下表所示：
7.[0008][0009]
在一实施例中，所述第一引物的碱基序列如序列表seq id no.1和seq id no.2所示，第一探针的碱基序列如序列表seq id no.3所示。
[0010]
在一实施例中，所述第二引物的碱基序列如序列表seq id no.4和seq id no.5所示，第二探针的碱基序列如序列表seq id no.6所示。
[0011]
在一实施例中，所述第三引物的碱基序列如序列表seq id no.7和seq id no.8所示，第三探针的碱基序列如序列表seq id no.9所示。
[0012]
在一实施例中，所述第四引物的碱基序列如序列表seq id no.10和seq id no.11所示，第四探针的碱基序列如序列表seq id no.12所示。
[0013]
在一实施例中，所述第一探针、第二探针、所述第三探针和所述第四探针的5’端均标记有荧光报告基团，3’端均标记有荧光淬灭基团。
[0014]
在一实施例中，所述荧光报告基团包括fam、hex、joe、tet、cy3、cy5、vic、rox中的任意一种，所述荧光淬灭基团包括bhq1、bhq2、bhq3、dabcy1中的任意一种，所述第一探针、第二探针、第三探针和第四探针中的所述荧光报告基团不同。
[0015]
另外，本发明还提供一种采用如上所述的真菌细菌四联核酸检测试剂盒的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
[0016]
s1、试剂准备：
[0017]
s11、取出试剂盒中的mix反应液1，在室温下融化并混匀，低速瞬间离心，取出试剂
盒中的mix反应液2，低速瞬间离心，置于冰上备用；
[0018]
s12、确定反应数n，反应数n至少比检测样本数多2，并按照10μl
×
n的mix反应液1，3μl
×
n的反应液二以及4μl
×
n的ddh2o配置反应体系；
[0019]
s13、将上述混合液震荡混匀，瞬时离心5秒，按18μl/管分装至pcr管中；
[0020]
s2、样本制备：
[0021]
s21、取3μl待测样本，阳性对照、阴性对照，分别加入到已分装的反应混合液中，盖紧pcr反应管盖，瞬时低速离心。将pcr反应管上机检测；
[0022]
s3、pcr扩增检测：
[0023]
s31、设定循环参数；
[0024]
s32、根据待测样本的ct值读取样本检测结果。
[0025]
另外，本发明还提供一种根据如上所述的真菌细菌四联核酸检测试剂盒的应用，所述试剂盒用于体外检测白色念珠菌、阴道毛滴虫、乳酸杆菌以及马氏巨球菌。
[0026]
本发明的试剂盒采用多重荧光定量pcr技术，设计白色念珠菌/阴道毛滴虫/乳酸杆菌/马氏巨球菌特异性探针及引物，在同一个反应体系中实现同时检测白色念珠菌/阴道毛滴虫/乳酸杆菌/马氏巨球菌。设计的引物和探针在ncbi的genebank数据库进行比对，检测探针和引物的特异性。
[0027]
本试剂盒操作简便且能有效防止污染，pcr荧光检测时间(从标本处理开始)仅为1.5-3小时，并且在同一反应体系中能够实现同时检测白色念珠菌/阴道毛滴虫/乳酸杆菌/马氏巨球菌。pcr荧光检测是全封闭操作，加入样本抽提产物及反应液后，可以不再打开管盖，减少了污染产生的机会。
[0028]
能够在同一个反应体系中同时检测白色念珠菌/阴道毛滴虫/乳酸杆菌/马氏巨球菌，解决了现有产品只能在一个反应管中检测一种真菌的问题。本发明还具有灵敏度高，可重复性强，操作简便，检测结果快速客观等优点，在临床诊断，疾病预防监测等领域具有极大的应用前景。
附图说明
[0029]
图1为本发明实施例的试剂盒用在包括白色念珠菌/阴道毛滴虫/乳酸杆菌/马氏巨球菌在内的30种不同的阴道微生物的扩增曲线图。
具体实施方式
[0030]
下面结合实施例对本发明提供的真菌细菌四联核酸检测试剂盒及其检测方法和应用作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0031]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
[0032]
在本技术中，mix反应液1包括taq启动酶，10x缓冲液，25mmmgcl2和10mmdntps。阳性对照为携带目标基因片段的质粒，阴性对照为无菌水。
[0033]
实施例1、试剂盒的制备
[0034]
本实施例的序列如下：
[0035]
[0036][0037]
其中，x1，x2，x3和x4为荧光报告基团，y1，y2，y3和y4为荧光淬灭基团。
[0038]
本实施例的检测试剂盒包括如下组分(25人份)：
[0039][0040]
实施例2
[0041]
1、试剂准备
[0042]
1.1、取出试剂盒中的mix反应液1，在室温下融化并混匀，低速瞬间离心。取出试剂盒中的mix反应液2，低速瞬间离心，置于冰上备用。
[0043]
1.2、确定反应数n：根据检测样本数计算所需反应数，如样本数为n，则反应数n＝(待鉴样本数n+阴性质控1+阳性质控1)，按下表配置反应体系。
[0044]
反应体系配置
[0045][0046]
1.3、反应体系分管：准备相应数量的pcr反应管，将上述混合液震荡混匀，瞬时离心5秒，按18μl/管分装至pcr管中。
[0047]
2、样本制备
[0048]
2.1、待测样本提取采用商品化的dna提取试剂盒。具体操作按照核酸提取试剂盒说明书进行操作。
[0049]
2.2、取2μl待测样本，阳性对照、阴性对照，分别加入到已分装的反应混合液中。盖紧pcr反应管盖，瞬时低速离心。将pcr反应管上机检测。
[0050]
3、pcr扩增检测
[0051]
3.1、将pcr反应管放置于荧光定量pcr仪扩增检测，本发明中采用的仪器以雅睿ma6000荧光定量pcr仪为例。
[0052]
3.2、循环参数设定：
[0053][0054]
4、实验有效性判定
[0055]
在本实施例中，本产品中白色念珠菌基因报告荧光为fam，阴道毛滴虫基因报告荧光为vic，乳酸杆菌基因报告荧光为cy5，马氏巨球菌基因报告荧光为rox。
[0056]
(1)阳性质控：
[0057]
fam通道有典型s型扩增曲线且ct值≤38。
[0058]
vic通道有典型s型扩增曲线且ct值≤38。
[0059]
cy5通道有典型s型扩增曲线且ct值≤38。
[0060]
rox通道有典型s型扩增曲线且ct值≤38。
[0061]
(2)阴性质控：
[0062]
fam通道，vic通道、cy5以及rox通道获得的ct大于≥40或无ct值，线形为直线或轻微斜线，无指数增长期。
[0063]
(3)只有同时满足1，2条件，实验有效，否则无效。
[0064]
5、检验结果的判定
[0065]
以abi 7500为例：反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节基线的start值，end值以及threshold值(用户可根据实际情况自行调整，start值可以在3-15，end值可以在5-20，在log图谱窗口设置threshold的value值，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线)，点击analysis自动获得分析结果，在report窗口读取检测结果。
[0066]
[0067][0068]
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。