一种往复式多流道PCR芯片及其使用方法和应用与流程

一种往复式多流道pcr芯片及其使用方法和应用
技术领域
1.本技术涉及生物学、分析化学及医学检测领域，具体而言涉及一种往复式多流道微流控pcr芯片及其使用方法和应用。


背景技术：

2.聚合酶链式反应（pcr）拥有广阔的应用，它能指数级扩增核酸，被应用在生物和医学中，尤其是核酸检测领域。当前核酸检测为了方便快捷，一般使用的是96孔/384孔板的实时荧光pcr，但仪器笨重，功耗很大，很难移动部署，并且需要有专门的pcr洁净实验室和专业人员操作，成本很高。同时，由于pcr需要95℃变性，使得其无法在高原环境直接运行（高原气压低，水的沸点不到95℃）。
3.微流控芯片将反应放在流道中进行，解决了易受环境污染的问题，因此有一些片上pcr的方案被提出来。其中较容易实现且成本较低的是专利申请公开号cn 112680341a中公开的弯曲流道型片上pcr方案，该方案由高压气瓶的气压驱动反应液体流过弯曲流道，在95℃温区和60℃温区之间反复经过，以此完成扩增热循环。用较高的气压可以保证整个反应体系有足够的压强，进而可以在高原上直接运行。然而这种方法也有其弊病：(1)需要激发光同时照亮所有循环，摄像头进行成像来拍摄每一个循环的荧光亮度，这需要较复杂的光学系统，增大系统的体积和成本，且需要经常性的校准，使用上较为不便。(2) 难以进行并行检测，难以同时检测多个标志物。(3) 由于温区固定，如果需要做rt-pcr检测rna（例如新冠病毒的检测），反转录(rt)步骤通常需要37-45℃，与pcr温度差异较大，需要在芯片外完成，会增加人工操作步骤；或者增大芯片安排专门的rt区域。(4) 需使用高压气瓶作为耗材，使用上较为麻烦，使用不当有爆裂的风险，可能造成人身损害。


技术实现要素：

4.为了解决相关技术中存在的问题，本技术提供一种往复式多流道微流控pcr芯片及其使用方法和应用。
5.本技术提供的往复式多流道微流控pcr芯片，解决了上述问题，能在温区统一设置的多个直线型短流道内完成多个样品的实时荧光pcr，并且无需额外空间就能支持全自动反转录酶-聚合酶链反应（rt-pcr）步骤。可以实现数个甚至上百个流道并行检测。
6.第一方面，本技术提供了一种往复式多流道微流控pcr芯片，包括多个直线型反应流道、位于每个直线型反应流道两端并与各自的直线型反应流道流体连通的气体腔室、布置在所述气体腔室外围的气体腔室控温装置、荧光检测装置；每个直线型反应流道上设置有加样口，多个直线型反应流道并列布置，每个直线型反应流道包括第一温区、第二温区和荧光检测区，荧光检测区位于第一温区和第二温区之间，反应体系通过在第一温区、荧光检测区和第二温区之间往复移动来完成pcr的多个热循环，荧光检测装置包括激发光发射器和荧光检测器，荧光检测器配置为与荧光检测区对准，当反应体系经过荧光检测区时荧光检测装置对反应体系进行荧光检测。
7.反应体系由两边腔室的气压差驱动，在第一温区、荧光检测区和第二温区之间往复移动。而两边腔室的气压由控温装置所控制的温度来决定。当需要在高原运行时，可同时提高两边气体腔室的温度以增加反应流道中的气压，从而升高沸点至95
°
c以上，保证可以进行正常的变性步骤。
8.在一些实施方式中，多个直线型反应流道配置为两层，其中第一层中的每个直线型反应流道的中心轴线与第二层中的每个直线型反应流道的中心轴线在垂直于所述多个直线型反应流道的延伸方向上偏移一定距离。
9.在一些实施方式中，两层直线型反应流道之间的间距为0.5~2mm在一些实施方式中，第一层中的每个直线型反应流道的中心轴线与第二层中的每个直线型反应流道的中心轴线偏移直线型反应流道的外直径的长度。
10.在一些实施方式中，激发光发射器和所述荧光检测器位于所述直线型反应流道一侧或相对的两侧。
11.在一些实施方式中，直线型反应流道的数量为大于2个。
12.在一些实施方式中，直线型反应流道的数量为大于10个、大于50个、大于100个、大于150个、大于200个、大于300个、大于400个、大于500个、大于1000个；或2-100个、2-1000个、100-500个、1000-10000个、10000-50000个，包括其间的任何值和范围。
13.在一些实施方式中，第一温区的温度为50-72℃，所述第二温区的温度为85-98℃。
14.在一些实施方式中，第一温区的温度为50-72℃、51-71℃、52-70℃、53-69℃、54-68℃、55-67℃、56-66℃、57-65℃、58-64℃、59-63℃、60-62℃或61℃，包括其间的任何值和范围。
15.在一些实施方式中，第二温区的温度为85-98℃、86-97℃、87-96℃、88-95℃、89-94℃、90-93℃或91-92℃，包括其间的任何值和范围。
16.在一些实施方式中，多个直线型反应流道中的每个还包括第三温区，反应体系通过在第一温区、第二温区和第三温区之间往复移动来完成pcr的多个热循环。
17.在一些实施方式中，第三温区的温度为50-72℃。
18.在一些实施方式中，第三温区的温度为50-72℃、51-71℃、52-70℃、53-69℃、54-68℃、55-67℃、56-66℃、57-65℃、58-64℃、59-63℃、60-62℃或61℃，包括其间的任何值和范围。
19.在一些实施方式中，直线型反应流道的制作材料为选自下列的一种或多种的组合：聚碳酸酯、聚乙烯、环烯烃类共聚物和环烯烃多聚物。
20.在一些实施方式中，直线型反应流道的横截面选自圆形或矩形，所述横截面的面积为0.005-0.15mm2。
21.在一些实施方式中，多个直线型反应流道之间的间距为0.5-3mm。
22.在一些实施方式中，第一温区的长度和所述第二温区的长度比为 (0.2-6)：1。
23.在一些实施方式中，第三温区的长度配置为与所述第一温区的长度相等。
24.在一些实施方式中，每个反应流道可以同时容纳一个或多个反应体系同时反应，各反应体系之间用矿物油隔开。
25.在一些实施方式中，反应流道可以同时容纳1-5反应体系同时反应。
26.第二方面，本技术提供了一种使用如权利要求1所述的往复式多流道微流控pcr芯
片的方法，其特征在于：包括如下步骤：1）将反应体系通过所述加样口注入所述多个直线型反应流道中的每个；2）将第二温区的温度加热到37-45℃，通过调节气体腔室的压强将反应体系移动到第二温区以进行反转录；3）将第二温区迅速加热到85-98℃，同时将第一温区加热到50-72℃；4）通过控制气体腔室中中的压强来控制反应体系在反应流道中的往复移动来完成pcr的多个热循环；当反应体系经过荧光检测区时荧光检测装置对反应体系进行荧光检测。
27.在一些实施方式中，在步骤2）中，将第二温区的温度加热到37-45℃、38-44℃、39-43℃、40-42℃或41℃，包括其间的任何值和范围。
28.在一些实施方式中，在步骤3）中，将第二温区迅速加热到85-98℃、86-97℃、87-96℃、88-95℃、89-94℃、90-93℃或91-92℃，包括其间的任何值和范围。
29.在一些实施方式中，在步骤3）中，第一温区加热到50-72℃、51-71℃、52-70℃、53-69℃、54-68℃、55-67℃、56-66℃、57-65℃、58-64℃、59-63℃、60-62℃或61℃，包括其间的任何值和范围。
30.第三方面，本技术提供了一种pcr检测仪，包括包括根据本技术的一些实施方式的往复式多流道微流控pcr芯片。
31.第四方面，本技术提供了根据本技术的一些实施方式的往复式多流道微流控pcr芯片用于pcr检测的应用。
32.综上所述，本技术包括以下至少一种有益技术效果：1.本技术的往复式多流道微流控pcr芯片使得pcr反应仅在短的直线流道上往复进行，即可完成多个pcr循环，本技术的往复式多流道微流控pcr芯片可以实现数道甚至上百流道并行检测，多个流道可以密集并行设计在一个芯片上，温区统一设定，可实现同时检测多个标志物；2.本技术的往复式多流道微流控pcr芯片能够在一个直线的短流道内完成实时荧光pcr，rt可以利用第二温区全自动进行，因此可以实现rt和pcr的全自动无缝衔接，减少人工干预并且可无需额外空间就支持全自动rt-pcr步骤；3.无需高压气瓶，减少体积和耗材种类，降低成本，也免除了高压气瓶爆炸的风险；4.因为每个循环pcr反应体系的液滴都会在同一个地方经过，无需使用摄像头拍摄，使用简单的点状激光激发、光电二极管接收即可，可大幅度减少光路和光学元件，提高灵敏度和信噪比，同时也大幅度减轻了单片机的处理压力，减少元件体积和成本。多流道并行检测可以统一激发，每个流道采用一个光电二极管进行荧光检测。
附图说明
33.以下附图仅仅是示例性的，而非限制性的，为了清楚起见，附图并不一定按实际比例绘制。
34.图1是根据本技术实施例1的往复式多流道微流控pcr芯片100的截面图。
35.图2是根据本技术实施例2的往复式多流道微流控pcr芯片100的截面图。
36.图3是根据本技术实施例1的往复式多流道微流控pcr芯片100中单独一个直线型反应流道2的一个实施方式的截面图。
37.图4是根据本技术实施例2的往复式多流道微流控pcr芯片100中单独一个直线型反应流道2的一个实施方式的截面图。
38.图5是单独一个直线型反应流道2中包含三个反应体系10的示意图。
39.附图标记说明： 1、单独一个往复式多流道微流控pcr芯片；2、直线型反应流道；3、气体腔室；4、气体腔室控温装置；5、荧光检测装置；6、加样口；7、第一温区；8、第二温区；9、荧光检测区；10、反应体系；11、激发光发射器；12、荧光检测器；13、第三温区；14、第一温区控温装置；15、第二温区控温装置；16、第三温区控温装置；17、矿物油；100、往复式多流道微流控pcr芯片。
具体实施方式
40.以下结合附图和实施例对本技术的技术方案作进一步详细说明。实施例并不旨在限制本技术，而仅仅用于解释本技术。
41.如无特殊说明，实施例中所使用的材料均可通过市售获得。实施例中未注明具体操作步骤、实验条件、所用到的仪器或装置的地方，本领域普通技术人员可根据本领域内常规使用的操作步骤、实验条件、仪器或装置进行，其在本技术的范围内。
42.实施例1参考图1和图3，本技术实施例1提供了一种往复式多流道微流控pcr芯片100，包括多个直线型反应流道2、位于每个直线型反应流道2两端并与各自的直线型反应流道2流体连通的气体腔室3、布置在所述气体腔室3外围的气体腔室控温装置4、荧光检测装置5；每个直线型反应流道2上设置有加样口6，多个直线型反应流道2并列布置，每个直线型反应流道2包括第一温区7、第二温区8和荧光检测区9，荧光检测区9位于第一温区7和第二温区8之间，反应体系10通过在第一温区7、荧光检测区9和第二温区8之间往复移动来完成pcr的多个热循环，荧光检测装置5包括激发光发射器11和荧光检测器12，荧光检测器12配置为与荧光检测区9对准，当反应体系10经过荧光检测区9时荧光检测装置5对反应体系10进行荧光检测。
43.激发光发射器11和荧光检测器12位于所述直线型反应流道2一侧或相对的两侧。激发光发射器11和所述荧光检测器12位于所述直线型反应流道2一侧时为落射式光路，激发光发射器11和所述荧光检测器12位于所述直线型反应流道2相对的两侧时为透射式光路。
44.直线型反应流道2的数量为2-100个。
45.第一温区7的温度配置为50-72℃、51-71℃、52-70℃、53-69℃、54-68℃、55-67℃、56-66℃、57-65℃、58-64℃、59-63℃、60-62℃或61℃，包括其间的任何值和范围。第二温区8的温度配置为85-98℃、86-97℃、87-96℃、88-95℃、89-94℃、90-93℃或91-92℃，包括其间的任何值和范围。
46.实施例1中的多个直线型反应流道在一层中整齐地并列排布，每个直线型反应流道2的温区统一设置，统一调节温度。
47.作为实施例1的一个替代方案，多个直线型反应流道2配置为两层（图中未示出该
替代方案），其中第一层中的每个直线型反应流道2的中心轴线与第二层中的每个直线型反应流道2的中心轴线在垂直于所述多个直线型反应流道的延伸方向上偏移一定距离。以便于荧光检测器12与每个直线型反应流道2的荧光检测区9之间无遮挡。
48.两层直线型反应流道2之间的间距为0.5mm第一层中的每个直线型反应流道2的中心轴线与第二层中的每个直线型反应流道2的中心轴线偏移直线型反应流道2的外直径的长度。
49.直线型反应流道2的制作材料为选自下列的一种或多种的组合：聚碳酸酯、聚乙烯、环烯烃类共聚物和环烯烃多聚物。
50.直线型反应流道2的横截面为圆形，所述横截面的面积为0.005-0.15mm2。
51.多个直线型反应流道2之间的间距为0.5-3mm。
52.第一温区7的长度和所述第二温区8的长度比为 (0.2-6)：1。
53.可选地，单条直线型反应流道2可以同时容纳一个或多个反应体系10同时反应，参考图5，图5示出了直线型反应流道2中同时存在三个反应体系10a、10b和10c，它们之间用矿物油17隔开。
54.全部pcr反应体系10加完后，封闭加样口6，用两侧气体腔室3中的气体温度变化来驱动整个体系左右移动，往复于各温区，完成pcr循环。在pcr循环中，各pcr反应体系10会依次通过荧光检测区9，由荧光检测器12分别检测其荧光强度。
55.若直线型反应流道的数量为m，每个反应流道可同时容纳n个反应体系同时反应，层数设置为p，那么本实施例的往复式多流道微流控pcr芯片100可同时容纳m
×n×
p个反应体系同时进行检测。
56.各温区的控温装置的工作原理如下：pvc薄膜电阻进行加热，热电偶或数字式温度传感器（如lm75, ds18b20等）进行测温，由单片机进行控制。当温度高于设定值时断开电阻供电停止加热，当温度低于设定值时接通电阻供电继续加热，从而维持设定温度。
57.要特别注意的是，由于引物和待检测的模板不可避免地会在流道壁上有极微量残留，从而可能进入其他液滴，因此在同一条流道中串行检测的多个pcr反应体系10，其引物最好不同，以避免互相串扰。不同反应体系10液滴可采用不同荧光颜色加以区分，或使用摄像头监控液滴的形态从而确定是第几个反应体系10经过检测器。
58.实施例2参考图2和图4，本技术实施例2提供了一种往复式多流道微流控pcr芯片100，其为实施例1的往复式多流道微流控pcr芯片1的一个变型，包括多个直线型反应流道2、位于每个直线型反应流道2两端并与各自的直线型反应流道2流体连通的气体腔室3、布置在所述气体腔室3外围的气体腔室控温装置4、荧光检测装置5；每个直线型反应流道2上设置有加样口6，多个直线型反应流道2并列布置，每个直线型反应流道2包括第一温区7、第二温区8、第三温区13和荧光检测区9，荧光检测区9位于第一温区7和第二温区8之间，反应体系10通过在第一温区7、荧光检测区9、第二温区8和第三温区13之间往复移动来完成pcr的多个热循环，荧光检测装置5包括激发光发射器11和荧光检测器12，荧光检测器12配置为与荧光检测区9对准，当反应体系10经过荧光检测区9时荧光检测装置5对反应体系10进行荧光检测。
59.激发光发射器11和荧光检测器12位于所述直线型反应流道2一侧或相对的两侧。激发光发射器11和所述荧光检测器12位于所述直线型反应流道2一侧时为落射式光路，激
发光发射器11和所述荧光检测器12位于所述直线型反应流道2相对的两侧时为透射式光路。
60.直线型反应流道2的数量为2-100个。
61.第一温区7的温度配置为50-72℃、51-71℃、52-70℃、53-69℃、54-68℃、55-67℃、56-66℃、57-65℃、58-64℃、59-63℃、60-62℃或61℃，包括其间的任何值和范围。第二温区8的温度配置为85-98℃、86-97℃、87-96℃、88-95℃、89-94℃、90-93℃或91-92℃，包括其间的任何值和范围。第三温区13的温度配置为50-72℃、51-71℃、52-70℃、53-69℃、54-68℃、55-67℃、56-66℃、57-65℃、58-64℃、59-63℃、60-62℃或61℃，包括其间的任何值和范围。
62.实施例2中的多个直线型反应流道在一层中整齐地并列排布，每个直线型反应流道2的温区统一设置，统一调节温度。
63.作为实施例2的一个替代方案，多个直线型反应流道2配置为两层（图中未示出该替代方案），其中第一层中的每个直线型反应流道2的中心轴线与第二层中的每个直线型反应流道2的中心轴线在垂直于所述多个直线型反应流道的延伸方向上偏移一定距离。以便于荧光检测器12与每个直线型反应流道2的荧光检测区9之间无遮挡。
64.两层直线型反应流道2之间的间距为0.5mm第一层中的每个直线型反应流道2的中心轴线与第二层中的每个直线型反应流道2的中心轴线偏移直线型反应流道2的外直径的长度。
65.直线型反应流道2的制作材料为选自下列的一种或多种的组合：聚碳酸酯、聚乙烯、环烯烃类共聚物和环烯烃多聚物。
66.直线型反应流道2的横截面为圆形，横截面的面积为0.005-0.15mm2。
67.多个直线型反应流道2之间的间距为0.5-3mm。
68.第一温区7的长度和所述第二温区8的长度比为 (0.2-6)：1。
69.可选地，单条直线型反应流道2可以同时容纳一个或多个（例如1-5个）反应体系10同时反应，参考图5，图5示出了直线型反应流道2中同时存在三个反应体系10a、10b和10c，它们之间用矿物油17隔开。
70.全部pcr反应体系10加完后，封闭加样口6，用两侧气体腔室3中的气体温度变化来驱动整个体系左右移动，往复于各温区，完成pcr循环。在pcr循环中，各pcr反应体系10会依次通过荧光检测区9，由荧光检测器12分别检测其荧光强度。
71.若直线型反应流道的数量为m，每个反应流道可同时容纳n个反应体系同时反应，层数设置为p，那么本实施例的往复式多流道微流控pcr芯片100可同时容纳m
×n×
p个反应体系同时进行检测。
72.图2中的结构为图1中的一个变体，在第二温区8的右侧增加了第三温区13，第三温区13的温度配置为与第一温区7相同。在这样的配置中，反应体系10在第一温区7到第三温区13的往复运动的过程中，一个往复循环即可经过两个循环。由于在一个循环中，反应体系10在第一温区7和第三温区13停留的时间较长，而在第二温区8停留的时间较短，因此这种设计可以使反应体系10在通过第二温区8的时候直线迅速通过，无需等待气体腔室控温装置4的变温，有效减少时间，可实现一个循环15秒的超快速循环。
73.全部pcr反应体系10液滴加完后，封闭支管，用两侧气体腔室3中的气体温度变化
来驱动整个体系左右移动，往复于各温区，完成pcr循环。在pcr循环中，各pcr反应体系10液滴会依次通过荧光检测器12，从而可以分别读取其荧光强度。
74.各温区的控温装置的工作原理如下：pvc薄膜电阻进行加热，热电偶或数字式温度传感器（如lm75, ds18b20等）进行测温，由单片机进行控制。当温度高于设定值时断开电阻供电停止加热，当温度低于设定值时接通电阻供电继续加热，从而维持设定温度。
75.要特别注意的是，由于引物和待检测的模板不可避免地会在流道壁上有极微量残留，从而可能进入其他液滴，因此在同一条流道中串行检测的多个pcr反应体系10，其引物应该不同，以避免互相串扰。不同反应体系10液滴可采用不同荧光颜色加以区分，或使用摄像头监控液滴的形态从而确定是第几个反应体系10经过检测器。
76.实施例3本实施例提供了一种使用往复式多流道微流控pcr芯片100的方法，包括如下步骤：1）将反应体系10通过加样口6注入多个直线型反应流道2中的每个；2）将第二温区8的温度加热到37-45℃，通过调节气体腔室3的压强将反应体系10移动到第二温区8以进行反转录；3）将第二温区8迅速加热到85-98℃，同时将第一温区7加热到50-72℃；4）通过控制气体腔室3中中的压强来控制反应体系10在反应流道中的往复移动来完成pcr的多个热循环；当反应体系10经过第一温区7和第二温区8之间时荧光检测装置5对反应体系10进行荧光检测。
77.在步骤2）中，将第二温区8的温度加热到37-45℃、38-44℃、39-43℃、40-42℃或41℃，包括其间的任何值和范围。
78.在步骤3）中，将第二温区8迅速加热到85-98℃、86-97℃、87-96℃、88-95℃、89-94℃、90-93℃或91-92℃，包括其间的任何值和范围。
79.在步骤3）中，第一温区7加热到50-72℃、51-71℃、52-70℃、53-69℃、54-68℃、55-67℃、56-66℃、57-65℃、58-64℃、59-63℃、60-62℃或61℃，包括其间的任何值和范围。
80.如果存在第三温区13，第三温区13的温度设置与第一温区7同步进行。
81.需要注意的是，如果检测不需要反转录步骤，那么步骤2）可省略。
82.本具体实施例仅仅是对本技术的解释，其并不是对本技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。