热敏型UDG酶突变体及其制备方法与应用与流程

本发明涉及生物，尤其涉及热敏型udg酶突变体及其制备方法与应用。

背景技术：

1、udg酶(尿嘧啶-dna糖基化酶)可选择性水解单链或双链dna中的尿嘧啶-糖苷键，切除尿嘧啶并在dna中产生无碱基位点，该核苷酸链在高温或高ph条件下极易水解断裂。

2、pcr反应最常见、最主要的污染物是pcr产物，防污染qpcr试剂盒以dutp取代dttp，所以其pcr产物都是含有du的dna链；在pcr开始前增加50℃的保温步骤，udg酶即可将反应体系中已有的u-dna污染物中的尿嘧啶碱基降解，并在随后变性步骤下dna链断裂，消除由于污染dna产生的扩增，从而保证扩增结果的特异性、准确性。

3、早期研究的udg酶野生型udg酶较为耐热，需要95℃处理长时间处理才能失活，即使95℃5～10min处理仍会残留有少量的活性，导致逆转录或pcr扩增产生的含du碱基的dna产物降解，进而干扰接下来的pcr反应。

4、目前有报导使用来源于嗜冷海洋细菌的热敏型udg酶，其在50℃即可完全失活。由于热敏型udg酶对热不稳定，在表达和纯化过程中存在酶活下降和不稳定等问题；且常温长时间运输、储存容易失活，导致效期短，因此目前市面上的产品均显示-20℃有效期仅为一年，需要避免反复冻融。研究表明，热敏感酶的结构比较柔软和灵活，蛋白结构稳定性较差，因此迫切需要对酶进行突变改造，降低其结构稳定性，再进行纯化方法开发，从而获得一个活性好，纯度高的热敏型udg酶突变体。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供热敏型udg酶突变体及其制备方法与应用。

2、本发明提供了udg酶突变体，其具有如seq id no:2所示的氨基酸序列。该突变体将如seq id no.1所示野生型udg酶的氨基酸序列中的第74位甘氨酸突变为丝氨酸，突变后序列为seq id no：2。

3、本发明还提供了编码所述udg酶突变体的核酸。

4、本发明实施例中，对编码所述udg突变体的核酸进行密码子优化，优化后的核酸序列如seq id no:3所示。该核酸序列适合于原核生物，特别是大肠杆菌中对本发明所述的突变体进行表达。

5、本发明还提供了含有所述核酸的载体。一些实施例中，所述载体的骨架载体为pet-30a载体。

6、本发明提供了转化或转染所述载体的宿主。一些实施例中，所述宿主为大肠杆菌。更具体的，所述大肠杆菌为bl21(de3)菌株。

7、本发明还提供了所述udg酶突变体的制备方法，其包括培养所述的宿主，获得含有udg酶突变体的培养物。

8、更具体的，所述热敏型udg酶突变体的制备方法包括：将编码seq idno：2所示序列udg酶突变体的核苷酸连入pet-30a载体得到表达载体，转入大肠杆菌进行表达纯化；经柱层析，获得热敏型udg酶。

9、本发明所述的制备方法中，所述纯化包括：菌体破碎、包涵体洗涤、udg酶复性、deae阴离子交换层析和heparin层析；

10、所述包涵体洗涤使用包涵体缓冲液来洗涤，所述缓冲液包括：40mm～60mm tris-hcl、5mm～10mm dtt、1m～3m尿素和0.5％～1％ triton x-100，ph 7.8～8.2；

11、所述udg酶变性使用包涵体溶解缓冲液，所述包涵体溶解缓冲液包括：40mm～60mmtris-hcl、5mm～10mm dtt和8m尿素，ph 7.8～8.2；

12、所述udg酶复性使用复性缓冲液，所述复性缓冲液包括：40mm～60mm tris-hcl、100mm～200mm nacl、1mm～3mm edta、1mm～5mm dtt、5％～15％甘油、0.5％～1％ tween20和蛋白浓度为0.2mg/ml～0.5mg/ml，ph7.8～8.2；

13、所述deae阴离子交换层析和heparin层析使用柱层析缓冲液，所述柱层析缓冲液包括：40mm～60mm tris-hcl、1mm～3mm edta、1mm～5mm dtt、5％～15％甘油和0.5％～1％tween 20，ph 7.8～8.2。

14、本发明所述的热敏型udg酶的制备方法中，编码seq id no：2所示序列udg酶突变体的核苷酸的制备方法包括：以seq id no：3所示的核酸序列为模板，使用seq id no：4和seq id no：5扩增引物，经扩增获得。

15、其中seq id no：4为上游引物，seq id no：5为下游引物。

16、本发明中，将扩增产物构建到pet-30a载体上，连接位点为ndei和ecori。

17、本发明中，所述宿主的构建包括将获得的表达载体转化入感受态细胞。

18、本发明所述的热敏型udg酶的制备方法中，所述表达的条件包括：以lb培养基于37℃培养至od值达到0.8～1.2，加入0.5mm～1mm iptg，于16℃进行过夜诱导表达12h～16h。

19、本发明所述的热敏型udg酶的制备方法中，所述纯化的方法包括：超声破碎、包涵体洗涤溶解、包涵体蛋白稀释复性、deae阴离子交换层析纯化和heparin柱纯化。该突变体在原核表达系统中以包涵体的形式表达，本发明使用包涵体复性的方法，并经进一步层析，获得酶活功能正常的热敏型udg酶。

20、本发明所述的热敏型udg酶的制备方法中，所述纯化过程在2℃～8℃的环境中进行。

21、本发明还提供了所述的udg酶突变体、所述的核酸、所述的载体、所述的宿主和/或所述制备方法制得的udg酶突变体在减少pcr反应中污染物中的应用。

22、本发明提供了用于减少pcr反应中污染物的制剂，包括如下i)～iv)中的至少一种：

23、i)、本发明所述的udg酶突变体；

24、ii)、编码本发明所述udg酶突变体的核酸；

25、iii)、本发明所述的载体；

26、iv)、本发明所述的宿主。

27、本发明还提供了一种减少pcr反应中污染物的方法，其包括用本发明所述的制剂处理pcr扩增产物。

28、本发明所述的“热敏型udg酶”在95℃热处理5min后，就能够完全失活，从而对pcr反应无干扰。而“野生型udg酶”热处理5min后依然具有部分活性。热敏型udg酶和野生型udg酶分别在95℃条件下加热5min，进行灭活实验。将hbv扩增后产物(含du碱基)稀释108次方，加入热处理后的0.5u热敏型udg酶突变体和t厂家野生型udg酶，进行扩增验证。结果如图4所示，热敏型udg酶的扩增曲线、ct值和对照一致，而野生型酶处理的曲线靠后，ct值偏大，为25.31。说明95℃热处理5min，热敏型udg酶能够完全失活，而野生型udg酶依然有部分活性，因此热敏udg酶突变体更适合一步法qpcr实验。

29、本发明提供的突变体将如seq id no.1所示的氨基酸序列中的第74位甘氨酸突变为丝氨酸，突变后序列为seq id no：2。与seq id no.1所示的野生型udg酶相比，该突变体能够发挥正常的去污染能力，热稳定性较野生型降低，95℃5min可完全失活。本发明基于大肠杆菌k-12udg酶结构，对酶进行突变改造，降低其结构稳定性，进行纯化方法开发，获得了活性好，纯度高的热敏型udg酶突变体。