一种快速提取核酸的方法

1.本发明涉及核酸提取技术领域，具体涉及一种快速提取核酸的方法。


背景技术：

2.核酸是脱氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna)的总称，是由许多核苷酸单体聚合成的一类生物聚合物，为生命的最基本物质之一，是所有已知生命形式必不可少的组成物质，是所有生物分子中最重要的物质。核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内。核酸由核苷酸组成，而核苷酸单体由五碳糖、磷酸基和含氮碱基组成。如果五碳糖是核糖，则形成的聚合物是rna；如果五碳糖是脱氧核糖，则形成的聚合物是dna。核酸携带遗传信息，在生物体的遗传、变异和蛋白质的生物合成中具有极其重要的作用。
3.核酸提取是指利用物理、化学等方法将核酸从样品中分离出来的过程，已经成为生命科学研究中必不可少的基础手段。核酸提取的原则或要求一般是要保证核酸一级结构的完整性，排除其他分子的污染(如提取dna时排除rna的干扰)，核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和高浓度的金属离子，尽可能降低蛋白质、多糖和脂类等大分子物质。前市场上的核酸提取方法是离心柱法和磁珠法。单纯的离心柱法需要使用高速离心机，磁珠法需要使用核酸提取仪，而资源匮乏的地方缺乏这些仪器，并且仪器的操作复杂，需要进行专业的培训方可上岗。
4.因此需要一种在整个过程无需用到特殊的仪器，用简单的磁棒或者磁铁可以完成核酸提取的方法。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种快速提取核酸的方法，该方法主要是采用磁珠、注射器、针头过滤器和加样针的组合装置，将例如鼻咽拭子样本裂解处理、注射器抽吸、磁珠吸附核酸，洗脱液洗脱核酸等步骤后，可以获得纯的核酸溶液用于现场检测，以解决现有技术中需要高速离心机、核酸提取仪等仪器且需要专业人士的问题。
6.本发明的目的及其技术问题的解决，可以采用以下技术方案来实现。
7.一方面，本发明提供了一种快速提取核酸的方法，该方法利用核酸快速提取装置进行，该装置包括注射器、针头过滤器、加样针以及磁铁进行，针头过滤器的两端均可与注射器和加样针相连，磁铁可以套在所述注射器上，该方法包括以下步骤：
8.1)裂解：将待测样品或者附着有待测样品的检测材料放入离心管，加入150-300μl裂解液，于45-65℃水浴孵育5-10min；
9.2)结合1：将步骤1)中的溶液、20-25μl蛋白酶k以及150-300μl结合液加入注射器的注射器腔中，混匀后静置5-10min；
10.3)结合2：向步骤2)中的溶液中加入150-300μl无水乙醇，混匀后静置5-10min，然后向其中加入10-50μl磁珠悬浮液，混匀后将磁铁套在注射器上，并去除液体；
11.4)漂洗：将步骤3)的装置从磁铁上取下，加入200-600μl漂洗液1，混匀后将磁铁套
在注射器上，静置10-60s后将去除液体，再加入200-800μl漂洗液2，混匀后将磁铁套在注射器上，静置10-60s后去除液体，室温静置5-10min；
12.5)洗脱：将步骤4)的装置从磁铁上取下，更换过滤器，连上加样针，加入洗脱液，混匀后置于磁铁上，静置10-60s，然后将溶有核酸的洗脱液挤出，获得核酸。
13.在本发明的实施方案中，注射器、针头过滤器、加样针可以为一次性的。
14.在本发明的实施方案中，裂解液包括：10-30mmol/l tris-hcl、5-20mmol/l edta、20-50mmol/l葡萄糖，溶剂为去离子水，ph＝4.0-5.5。
15.在本发明的实施方案中，结合液包括：1-5mol/l盐酸胍、5-25mmol/l柠檬酸钠、1-2％triton x-100、0.5-5mmol/l edta，溶剂为去离子水，ph＝4.0-5.5。
16.在本发明的实施方案中，磁珠的直径可以为300-400nm，例如310nm、320nm、330nm、340nm、340nm、350nm、360nm、370nm、380nm、390nm、400nm。在本发明的具体实施方案中，优选采用浓度为10-30mg/ml的磁珠悬浮液。在本发明的具体实施方案中，本发明采用的磁珠修饰基团可以为羧基或者硅烷基。
17.在本发明的实施方案中，漂洗液1包括：1-5mol/l naac、20-40％无水乙醇(v/v)，溶剂为去离子水，ph＝4.0-5.5。在本发明的实施方案中，漂洗液2包括：10-30mmol/l tris-hcl、0.5-5mmol/l edta、5-25mmol/l柠檬酸钠和0.3-0.7l/l的无水乙醇，溶剂为去离子水，ph＝8.0-8.5。
18.在本发明的实施方案中，洗脱液可以为去离子水、无rna酶的超纯水或者te缓冲液(te buffer)。
19.在本发明的实施方案中，在步骤1)中，如果待提取的核酸为rna，则再加入捕获rna溶液和rna酶抑制剂。
20.在本发明的实施方案中，捕获rna溶液是本领域技术人员众所周知的，例如可以为2-5μg/μl carrier rna溶液。
21.在本发明的实施方案中，rna酶抑制剂是本领域技术人员众所周知的，例如可以为焦磷酸二乙酯、异硫氰酸胍、氧钒核糖核苷复合物等。
22.在本发明的实施方案中，在步骤3)和步骤4)中，借助注射器的推压功能去除注射器腔中的液体，只保留磁珠。
23.在本发明的实施方案中，在步骤3)中将磁铁套在注射器上，靠近针头过滤器的一端，使磁珠吸附在注射器腔靠近针头过滤器的一端。
24.本发明与现有技术相比具有明显的有益效果。借由上述技术方案，本发明至少具有下列有益技术效果：本发明将磁珠、注射器、针头过滤器和磁铁相结合，将样本裂解处理、注射器抽吸、磁珠吸附核酸，洗脱液洗脱核酸等步骤后，就可以获得纯的核酸溶液用于现场检测。整个提取过程快速、简便，无需特殊的仪器，用简单的磁棒或者磁铁可以完成核酸提取。
附图说明
25.图1为本发明方法所利用的核酸快速提取装置的的示意图，包括注射器、针头过滤器、加样针以及磁铁。
26.图2为本发明所利用的核酸快速提取装置行使推压功能时的组合图。
27.图3本发明实施案例4得到的荧光定量pcr扩增检测结果。
28.其中，1-注射器，2-针头过滤器，3-磁铁，4-加样针。
具体实施方式
29.下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用来限制本发明的保护范围。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换，所有这些修改和替换都落入了本发明权利要求书请求保护的范围内。
30.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
31.实施例1
32.在本实施例中，采用本发明的方法对鲍氏志贺菌(shigella bogdii)中的dna进行提取。图1示意性显示了本实施例所用到的核酸快速提取装置，包括注射器1、针头过滤器2、磁铁3以及加样针4，针头过滤器2的两端均可与注射器1和加样针4相连，磁铁3可以套在注射器1上，注射器1、针头过滤器2、加样针4为一次性的，图2为该装置行使推压功能时的组合图，在本实施例中，提取过程如下：
33.1)裂解：取新鲜鲍氏志贺菌培养液1.0ml放入2.0ml离心管，加入200μl裂解液，于45-65℃水浴孵育5min，裂解液包括10mmol/l tris-hcl、20mmol/l edta、50mmol/l葡萄糖，溶剂为去离子水，ph＝5.5；
34.2)结合1：静置冷却至室温，将步骤1)中的溶液转移至注射器1和针头过滤器2相连的核酸提取装置中(采用2.0ml注射器)，向注射器腔里加入20μl蛋白酶k混匀，之后再加入200μl结合液，混匀后静置5min，其中结合液包括1mol/l盐酸胍、25mmol/l柠檬酸钠、2％triton x-100、1mmol/l edta，溶剂为去离子水，ph＝4.0；
35.3)结合2：向步骤2)的溶液中加入200μl无水乙醇，混匀后静置5min，然后向其中加入20μl磁珠悬浮液(磁珠悬浮液浓度为10-30mg/ml，且磁珠直径为320nm)，混匀后将磁铁3套在注射器1靠近针头过滤器2的一端，如图3所示，使磁珠吸附在注射器腔靠近针头过滤器2的一端，静置30s后，借助注射器1的推压功能，将液体去除，只保留磁珠；
36.4)漂洗：将步骤3)的装置从磁铁3上取下，加入300μl漂洗液1，混匀后将磁铁3套在注射器1靠近针头过滤器2的一端，如图3所示，静置30s后借助注射器1的推压功能将液体去除，保留磁珠，再加入500μl漂洗液2，混匀后将磁铁3套在注射器1上，静置30s后借助注射器1的推压功能去除液体，室温静置5min，其中：
37.漂洗液1包括：5mol/l naac、20％无水乙醇(v/v)，溶剂为去离子水，ph＝4.0，
38.漂洗液2包括：30mmol/l tris-hcl、0.5mmol/l edta、5mmol/l柠檬酸钠和0.7l/l的无水乙醇，溶剂为去离子水，ph＝8.5；
39.5)洗脱：将步骤4)的装置从磁铁3上取下，更换针头过滤器2，连上加样针4，加入适量去离子水作为洗脱液，混匀后将磁铁3套在注射器1上，静置30s，然后借助注射器1的推压功能将溶有核酸的洗脱液挤出，获得dna，整个提取过程在1小时内完成，之后采用nanodrop 1000对提取的dna进行浓度和纯度测定，结果如表1。
40.表1
[0041][0042][0043]
测得的结果表明，提取的dna浓度大于600ng/μl，纯度在1.8左右。纯dna：od
260
/od
280
≈1.8，因此提取的dna纯度和浓度符合检测要求。
[0044]
实施例2
[0045]
在本实施例中，采用本发明的方法对293t细胞(购自北京协和医院)中的rna进行提取。图1示意性显示了本实施例所用到的核酸快速提取装置，包括注射器1、针头过滤器2、磁铁3以及加样针4，针头过滤器2的两端均可与注射器1和加样针4相连，磁铁3可以套在注射器1上，注射器1、针头过滤器2、加样针4为一次性的，提取过程如下：
[0046]
1)裂解：取293t细胞培养液200μl放入2.0ml离心管，加入200μl裂解液，3μl捕获rna溶液(上海碧云天生物技术有限公司，产品编号r0036-1mg)，4μl rna酶抑制剂(北京索莱宝科技有限公司，货号：d8210)，于45-65℃水浴孵育5min，其中裂解液包括30mmol/l tris-hcl、10mmol/l edta、20mmol/l葡萄糖，溶剂为去离子水，ph＝4.5；
[0047]
2)结合1：静置冷却至室温，将步骤1)中溶液转移至图1所示的核酸提取装置中(采用2.0ml注射器)，向注射器腔里加入20μl蛋白酶k混匀，之后再加入200μl结合液，混匀后静置5min，其中结合液包括5mol/l盐酸胍、5mmol/l柠檬酸钠、1％triton x-100、5mmol/l edta，溶剂为去离子水，ph＝4.0；
[0048]
3)结合2：向步骤2)的溶液中加入200μl无水乙醇，混匀后静置5min，然后向其中加入20μl磁珠悬浮液(磁珠悬浮液浓度为10-30mg/ml，且磁珠的直径为320nm)，混匀后将磁铁3套在注射器1上，使磁珠吸附在注射器腔靠近针头过滤器2的一端，静置30s后，借助注射器1的推压功能，将液体去除，只保留磁珠；
[0049]
4)漂洗：将步骤3)的装置从磁铁3上取下，加入300μl漂洗液1，混匀后置于磁铁3上，静置30s后借助注射器1的推压功能将液体去除，保留磁珠，再加入500μl漂洗液2，混匀后将磁铁3套在注射器1上，静置30s后借助注射器1的推压功能去除液体，室温静置5min，其中：
[0050]
漂洗液1包括：1mol/l naac、40％无水乙醇(v/v)，溶剂为去离子水，ph＝5.5，
[0051]
漂洗液2包括：10mmol/l tris-hcl、5mmol/l edta、25mmol/l柠檬酸钠和0.3l/l的无水乙醇，溶剂为去离子水，ph＝8.0；
[0052]
5)洗脱：将步骤4)的装置从磁铁3上取下，更换针头过滤器2，连上加样针4，加入适量无rna酶的超纯水作为洗脱液，混匀后将磁铁3套在注射器1上，静置30s，然后借助注射器的推压功能将溶有核酸的洗脱液挤出，获得rna，整个提取过程在1小时内完成，之后采用nanodrop 1000对提取的rna进行浓度和纯度测定，结果如表2。
[0053]
表2
[0054] rna浓度(ng/μl)od
260
/od
280
检测样本11568.51.93检测样本21572.11.90
[0055]
测得的结果表明，提取的rna浓度大于1500ng/μl，纯度在1.9左右。纯rna：1.7＜od
260
/od
280
＜2.0，因此提取的rna纯度和浓度符合检测要求。
[0056]
实施例3
[0057]
竞品分析
[0058]
本发明方法(提取方法同实施例2)同市售离心柱型试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，货号：dp302)提取方法进行对比，操作按照试剂盒说明书进行，提取样本为293t细胞，提取完成之后采用nanodrop 1000对提取的rna进行浓度和纯度测定，结果如表3：
[0059]
表3
[0060] rna浓度(ng/μl)od
260
/od
280
本发明方法1582.61.91离心柱型方法1046.22.03
[0061]
测得的结果表明，本方法提取的rna浓度大于1500ng/μl，纯度在1.9左右。离心柱型方法提取的rna浓度在1000ng/μl左右，纯度在1.9左右。纯rna：1.7＜od
260
/od
280
＜2.0，因此本方法提取的rna纯度优于市售离心柱型方法，而提取的rna浓度也高于市售离心柱型方法，因此本发明方法符合核酸提取的要求。
[0062]
实施例4
[0063]
采用本发明的方法提取的rna进行下游荧光定量pcr实验。
[0064]
反转录反应：反转录实验分两步进行，首先取5ng提取的293t细胞的总rna，加入1μl dntp(10mm)、1μl的oligo dt primer和nuclease-free h2o至总体积18μl的反应混合液，之后将该混合液在70℃孵育5min，再将其置于冰上并保持2min。第二步，向上述混合液中加入5μl 5
×
rt buffer，1μl m-mlv reverse transcriptase(rnase h-，200u/μl)和1μl rna酶抑制剂(40u/μl)，然后在42℃条件下孵育60min，然后在85℃条件下孵育5min终止反应，置于冰上冷却。反转录实验操作采用m-mlv first strand cdna试剂盒(美国bio-tekg公司，货号：tq2501)，并按照操作指南进行实验。
[0065]
正向引物1μlcdna(200ng/μl)0.5μl20
×
mastermix1μlnuclease-free h2o16.5μl反向引物1μl总计20μl
[0066]
real-time pcr实验采用faststart essential dna green master试剂盒(美国roche公司，货号：6402712001)，并根据操作指南进行实验。实时检测过程在stepone plus real-time pcr仪器(美国abi公司)上操作进行，程序如下：在94℃下10分钟，然后进行45个循环(95℃，20秒，60℃，30秒和72℃，20秒)；将反应体系在72℃下进一步温育10分钟以延伸任何不完全的产物，扩增结果如图3所示。从图3可以看出，阳性对照和提取出的样本rna均发生了扩增，而阴性对照没有扩增，证明本方法提取的rna可以用于下游的样本rna检测。
[0067]
最后应说明的是，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制。尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对前述各实施例所记载的技术方案
进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换均落入本发明权利要求书请求保护的范围内。