一种包含猪瘟病毒E2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白的融合蛋白及二联亚单位疫苗的制作方法

本发明属于兽用生物制品，具体涉及一种包含猪瘟病毒e2蛋白和猪圆环病毒2型cap蛋白的融合蛋白及二联亚单位疫苗。

背景技术：

1、猪瘟病毒(swine fevervirus，csfv)为有囊膜病毒，40～60nm，单股正链rna。csfv基因组长约123kb，仅含有一个大的开放性阅读框架(orf)，此orf翻译成含3898个氨基酸残基，分子量约438kda的多聚蛋白，并进一步在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下加工为成熟蛋白。在结构蛋白中，最具有免疫防治研究价值的是e0和e2，尤其是e2蛋白是目前亚单位疫苗首选蛋白。

2、e2蛋白为囊膜糖蛋白，是病毒主要的抗原蛋白，也是三个病毒糖蛋白中保守性最低、最易变异的分子。e2蛋白常以100kda的同源二聚体形式存在于病毒粒子及猪瘟病毒感染的细胞表面。e2蛋白可诱导产生抗病毒的中和抗体，hulst用e2双相油包水乳剂免疫猪，能抵抗100ld50 csfvbrescia毒株强毒的攻击。e2蛋白骨架由370个氨基酸(orf编码的690～1060氨基酸残基)组成，并以其c端的40个疏水氨基酸锚定在膜上。

3、猪圆环病毒(porcine circovirus，pcv)属于圆环病毒科圆环病毒属，病毒无囊膜、是单链负股环状dna病毒，是最小的动物病毒之一。传统的观点认为猪圆环病毒存在两个基因型：猪圆环病毒1型(pcv1)和猪圆环病毒2型(pcv2)，其中pcv2具有致病性。猪圆环病毒2型cap蛋白的n端包含了一个富含精氨酸的核定位序列，负责介导rep复合物与核酸的相互作用，进而参与病毒的dna复制。研究表明核定位序列对cap蛋白的免疫原性具有重要影响，缺失后会导致其诱导中和抗体的能力显著降低。目前虽有全长和n端32个氨基酸截短型的cap蛋白在杆状病毒中获得表达并可以形成病毒样颗粒(virus-likeparticle，vlp)，但完整cap蛋白的表达会影响其在表达系统中的表达量，然而整段的缺失却又有可能会影响病毒样颗粒表面的特性及病毒样颗粒的稳定性，从而影响其免疫原性。

4、现有技术中虽然有关于猪瘟-猪圆环病毒2型的二联疫苗，但是均为采用单独表达后再混合的方案，纯化步骤繁琐，因此亟需利用一次表达过程，同时生产两种病毒的亚单位疫苗方案，并解决表达量受限的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种包含猪瘟病毒e2蛋白和猪圆环病毒2型cap蛋白的融合蛋白及二联亚单位疫苗，可在一次表达过程中，同时生产两种病毒的亚单位疫苗，并且表达量不受cap蛋白n端富含碱性氨基酸的核定位信号区的影响，蛋白纯化简单，不需要蛋白复性、离子交换层析等复杂工艺。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种包含猪瘟病毒e2蛋白和猪圆环病毒2型cap蛋白的融合蛋白，所述融合蛋白的结构从n端到c端包括：信号肽、去掉c端胞内区的猪瘟病毒e2蛋白、fc、tev酶切基序和猪圆环病毒cap蛋白。

4、优选的，所述信号肽的来源包括小鼠iggkappa链信号肽和/或家蚕免疫球蛋白信号肽；

5、所述fc的来源包括猪igg fc。

6、本发明提供了一种利用cho细胞表达的上述融合蛋白，所述融合蛋白的结构从n端到c端包括：小鼠igg kappa链信号肽、去掉c端胞内区的猪瘟病毒e2蛋白、猪igg fc、tev酶切基序和猪圆环病毒2型cap蛋白；

7、所述小鼠iggkappa链信号肽的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述去掉c端胞内区的猪瘟病毒e2蛋白的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述猪igg fc的核苷酸序列如seqid no.3所示，所述tev酶切基序的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述猪圆环病毒2型cap蛋白的核苷酸序列如seq id no.5所示。

8、优选的，所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.7所示。

9、本发明还提供了一种利用昆虫细胞表达的上述融合蛋白，所述融合蛋白的结构从n端到c端包括：家蚕免疫球蛋白信号肽、去掉c端胞内区的猪瘟病毒e2蛋白、猪igg fc、tev酶切基序和猪圆环病毒2型cap蛋白；

10、所述家蚕免疫球蛋白信号肽的核苷酸序列如seq id no.8所示，所述去掉c端胞内区的猪瘟病毒e2蛋白的核苷酸序列如seq id no.9所示，所述猪igg fc的核苷酸序列如seqid no.10所示，所述tev酶切基序的核苷酸序列如seq id no.11所示，所述猪圆环病毒2型cap蛋白的核苷酸序列如seq id no.12所示。

11、优选的，所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.14所示。

12、优选的，所述融合蛋白切除信号肽后分泌在培养上清中，切除信号肽后的氨基酸序列如seq id no.15所示。

13、本发明还提供了一种包含上述融合蛋白的重组载体。

14、本发明还提供了一种表达上述融合蛋白的重组细胞系。

15、本发明还提供了上述融合蛋白、上述重组载体或上述重组细胞系在制备猪瘟和猪圆环病毒2型二联亚单位疫苗中的应用。

16、本发明还提供了一种猪瘟和猪圆环病毒2型的二联亚单位疫苗，以上述重组细胞系表达的融合蛋白为抗原。

17、有益效果：本发明提供了一种包含猪瘟病毒e2蛋白和猪圆环病毒2型cap蛋白的融合蛋白，在融合蛋白中加入fc标签，使猪瘟病毒e2蛋白形成二聚体，延长蛋白半衰期，促进抗原递呈。本发明将e2、fc和cap蛋白融合表达，使核定位信号位于融合蛋白的中部，消除了其位于蛋白n端时产生的不利影响，使得表达量不受cap蛋白n端富含碱性氨基酸的核定位信号区的影响，故无需进行特定序列的缺失。本发明在融合蛋白中还加入tev蛋白酶酶切基序，经tev酶切产生的猪圆环病毒2型cap蛋白，最接近天然病毒。

18、本发明还提供了包含所述融合蛋白的重组载体以及表达所述融合蛋白的重组细胞系，可利用一次表达过程，同时生产两种病毒的亚单位疫苗，纯化过程简单，利用商品化proteina填料纯化蛋白，不需要蛋白复性、离子交换层析等复杂工艺。利用本发明所述融合蛋白形成的二联亚单位疫苗，猪瘟e2以二聚体形式存在，圆环病毒2型cap蛋白以vlps形式组成存在。

技术特征：

1.一种包含猪瘟病毒e2蛋白和猪圆环病毒2型cap蛋白的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的结构从n端到c端包括：信号肽、去掉c端胞内区的猪瘟病毒e2蛋白、fc、tev酶切基序和猪圆环病毒2型cap蛋白。

2.根据权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述信号肽的来源包括小鼠igg kappa链信号肽和/或家蚕免疫球蛋白信号肽；

3.一种利用cho细胞表达的权利要求1或2所述融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的结构从n端到c端包括：小鼠igg kappa链信号肽、去掉c端胞内区的猪瘟病毒e2蛋白、猪iggfc、tev酶切基序和猪圆环病毒2型cap蛋白；

4.一种利用昆虫细胞表达的权利要求1或2所述融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的结构从n端到c端包括：家蚕免疫球蛋白信号肽、去掉c端胞内区的猪瘟病毒e2蛋白、猪iggfc、tev酶切基序和猪圆环病毒2型cap蛋白；

5.根据权利要求3或4所述融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白切除信号肽后分泌在培养上清中，切除信号肽后的氨基酸序列如seq id no.15所示。

6.一种包含权利要求1或2所述融合蛋白、权利要求3～5任一项所述融合蛋白的重组载体。

7.一种表达权利要求1或2所述融合蛋白、权利要求3～5任一项所述融合蛋白的重组细胞系。

8.权利要求1或2所述融合蛋白、权利要求3～5任一项所述融合蛋白、权利要求6所述重组载体或权利要求7所述重组细胞系在制备猪瘟和猪圆环病毒2型二联亚单位疫苗中的应用。

9.一种猪瘟和猪圆环病毒2型的二联亚单位疫苗，其特征在于，以权利要求7所述重组细胞系表达的融合蛋白为抗原。

技术总结
本发明提供了一种包含猪瘟病毒E2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白的融合蛋白及二联亚单位疫苗，涉及兽用生物制品技术领域。本发明将E2、Fc和Cap蛋白融合表达，并在融合蛋白中加入TEV蛋白酶酶切基序。本发明还提供了包含所述融合蛋白的重组载体以及表达所述融合蛋白的重组细胞系，可利用一次表达过程，同时生产两种病毒的亚单位疫苗，纯化过程简单，利用商品化proteinA填料纯化蛋白，不需要蛋白复性、离子交换层析等复杂工艺。利用本发明所述融合蛋白形成的二联亚单位疫苗，猪瘟E2以二聚体形式存在，猪圆环病毒2型Cap蛋白以VLPs形式组成存在。

技术研发人员：李雪峰,康斌,武玉梅,董鹏,张金龙,赵炳武,李少丽,王家福
受保护的技术使用者：金河佑本生物制品有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12