一种CRF01_AE流行重组毒株LTR荧光报告系统稳转株及其构建方法

本发明涉及生化，具体涉及一种crf01_ae流行重组毒株ltr荧光报告系统稳转株及其构建方法。

背景技术：

1、获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiency syndrome,aids)即艾滋病，是由于人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,hiv)感染引起的极具危害性的传染性疾病，可通过直接的体液接触而传染给其他人群。

2、hiv通过体液进入宿主体内，主要攻击宿主的免疫系统最为重要的cd4+t细胞，随着病毒的复制和感染新的细胞，宿主的cd4+t细胞数量锐减，其正常免疫系统逐步被瓦解直至崩溃，免疫系统无力识别和清除癌变细胞和病原体甚至控制不了体内正常菌群的生长，最终宿主死于各种可能的机会性感染或癌症。

3、hiv-1通过两端长末端重复序列(long terminal repeated，ltr)的结构将原病毒dna借助整合酶的作用整合到宿主的基因组dna中。

4、高效抗逆转录病毒联合疗法(highly active antiretroviral therapy,haart)即鸡尾酒疗法，联合多种作用于病毒感染过程中不同作用机制的抗病毒药物，包括抑制病毒逆转录、抑制病毒蛋白酶活性以及抑制病毒整合三方面，共同作用于患者体内病毒，减少单一用药导致的耐药性，从而达到抑制病毒复制和传播的作用。

5、haart疗法尽管有效，但却存在缺陷，即一旦患者停止服用药物，即便其已检测不到hiv的存在，但病毒载量仍会在极短时间内迅速反弹，导致严重的病毒血症的发生。这迫使患者需持续不断的服用药物而达到控制病毒进程的目的。

6、hiv难以根治的主要原因是存在于患者体内的hiv潜伏储存库。一部分hiv感染宿主cd4+t细胞整合了hiv前病毒dna后，细胞从活化状态逆转为静息的状态，hiv前病毒dna沉默在这些细胞中，形成一种半衰期长但转录沉默的前病毒。这部分感染hiv的细胞并不会表达hiv相关物质，从而产生免疫逃逸现象，同时逃脱抗逆转录病毒药物的杀灭。稳定整合的hiv前病毒dna成为了宿主细胞的遗传物质的一部分，只有当刺激信号出现，才会重新启动转录，成为新的感染源。

7、目前，对于如何形成hiv潜伏感染的机制尚不明确，研究发现，转录抑制对于hiv潜伏期的建立和维持至关重要，而hiv潜伏库是根除hiv的最大障碍。

8、自从1983年分离出hiv-1，就发现其具有高度的基因多态性。通过对病毒基因序列的分析，发现在进化树上欧洲/北美地区的序列与非洲地区的序列分开形成不同的进化簇，据此将hiv-1分为欧洲/北美株和非洲株。此后，随着序列的积累，发现在进化树上病毒的env序列存在多个彼此间几乎等距的进化支，1992年将这些进化支命名为a、b、c、d、e、f基因型，此前的欧洲/北美株被称为b亚型。1998年提出hiv-1流行重组体(circulatingrecombinant forms，crf)的概念，指出它是已流行的hiv-1重组毒株，判断标准是至少测定了2个毒株的全长基因组序列；测序的毒株具有相同的基因组结构并与已知的不同；至少在2个没有流行病学联系的个体发现了该病毒。满足这些标准的当时有4个重组毒株(a/e、a/g、a/g/i和a/b)，a/e是首个确定基因组嵌合结构的，被编为第1号，命名为crf01_ae。授权公告号为cn 104328091 b的中国发明专利公开了hiv-1crf01_ae亚型(humanimmunodeficiency virus typeⅰsubtype crf01_ae)临床分离株gx002，其保藏号为cgmccno.8787。

技术实现思路

1、本发明所要解决的问题为如何激活hiv潜伏储存库的转录抑制。

2、为了解决以上问题，本发明提供了一种重组载体。

3、本发明提供的重组载体，含有荧光素酶基因表达盒，所述荧光素酶基因表达盒是包含荧光素酶基因及所述荧光素酶基因表达所需的调控序列的双链dna分子，所述荧光素酶基因的核苷酸序列是序列1的第907-2559位所述调控序列(ltr)的核苷酸序列是序列1的第40-845位。

4、上述重组载体中，所述荧光素酶基因表达盒的核苷酸序列是序列1的第40-2559位。

5、所述重组载体的核苷酸序列是序列1。

6、含有权利要求1、2或3所述的重组载体的重组细胞也属于本发明的保护范围。

7、本发明所述的重组细胞，是将上述的重组载体导入哺乳动物细胞得到的重组哺乳动物细胞。

8、所述重组细胞中，所述哺乳动物细胞为人胚肾细胞系。

9、所述重组细胞中，所述人胚肾细胞系为hek293t细胞。

10、所述重组细胞具有荧光素酶活性。

11、本发明还提供了构建上述重组细胞的方法。

12、构建上述重组细胞的方法，包括将上述重组载体导入上述哺乳动物细胞得到重组细胞。

13、本发明还提供了上述重组载体、重组细胞或构建重组细胞的方法在下述任一种中的应用：

14、1)制备识别或辅助识别hiv-1ltr的产品；

15、2)制备激活hiv病毒转录的产品；

16、3)制备筛选艾滋病药物的产品。

17、所述hiv病毒或hiv-1可为hiv-1crf01_ae亚型(human immunodeficiency virustypeⅰsubtype crf01_ae)临床分离株gx002，其保藏号为cgmcc no.8787。所述艾滋病可为由hiv-1crf01_ae亚型(human immunodeficiency virus typeⅰsubtype crf01_ae)临床分离株gx002引起的疾病。

18、采用激活并杀死(shock and kill)治疗研究策略，即先激活潜伏免疫细胞内的休眠病毒再消除，通过转录激活潜伏的病毒，使艾滋病毒得以表达和复制，从而清除病毒。这种方法依赖于转录沉默的hiv-1启动子的抑制或激活。

19、通过成功构建了crf01_ae亚型临床分离株gx002 ltr区的荧光报告系统，可广泛应用于治疗艾滋病药物的筛选，对艾滋病的防治研究具有重要的应用价值和意义。

技术特征：

1.重组载体，其特征在于，所述重组载体含有荧光素酶基因表达盒，所述荧光素酶基因表达盒是包含荧光素酶基因及所述荧光素酶基因表达所需的调控序列的双链dna分子，所述荧光素酶基因的核苷酸序列是序列1的第907-2559位，所述调控序列(ltr)的核苷酸序列是序列1的第40-845位。

2.如权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述荧光素酶基因表达盒的核苷酸序列是序列1的第40-845位。

3.如权利要求1或2所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的核苷酸序列是序列1。

4.含有权利要求1、2或3所述的重组载体的重组细胞。

5.如权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是将权利要求1、2或3所述的重组载体导入哺乳动物细胞得到的重组哺乳动物细胞。

6.如权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述哺乳动物细胞为人胚肾细胞系。

7.如权利要求6所述的重组细胞，其特征在于，所述人胚肾细胞系为hek293t细胞。

8.如权利要求4-7中任一所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞具有荧光素酶活性。

9.构建权利要求5-8中任一所述的重组细胞的方法，包括将权利要求1、2或3所述的重组载体导入权利要求5-8中所述哺乳动物细胞得到重组细胞。

10.权利要求1、2或3所述的重组载体、权利要求4-8中任一所述的重组细胞或权利要求9所述的方法在下述任一种中的应用：

技术总结
本发明公开了一种CRF01_AE流行重组毒株LTR荧光报告系统稳转株及其构建方法。本发明涉及生化技术领域。含HIV‑1 GX002_LTR的荧光素酶报告基因的载体序列为序列表中序列1所示，含有荧光素酶基因表达盒，荧光素酶基因表达盒是包含荧光素酶基因及荧光素酶基因表达所需的调控序列的双链DNA分子，荧光素酶基因的核苷酸序列是序列1的第907‑2559位，调控序列(LTR)的核苷酸序列是序列1的第40‑845位。将载体HIV‑1 GX002_LTR荧光报告载体导入细胞，构建含HIV‑1 GX002_LTR的荧光素酶报告基因的细胞株，可以用于艾滋病药物的筛选，对艾滋病的防治研究具有重要的应用价值。

技术研发人员：李林,贾磊,刘梦莹,郭星,李韩平,刘永健,韩婧婉,张伯寒,王晓林,李天一,李敬云
受保护的技术使用者：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12