一种酶法合成次黄嘌呤的方法与流程

1.本发明涉及次黄嘌呤制备技术领域，尤其涉及一种采用酶法合成次黄嘌呤的方法。


背景技术：

2.次黄嘌呤(hypoxanthine)又名6-羟基嘌呤，相对分子量为136.11，分子式为c5h4n4o，次黄嘌呤是一种非重要的生物嘌呤碱，在人体内分布广泛，能够参与调节人体内的一些重要生理机能，具有降低血压、平喘、治疗痛风等药理活性，还可用于治疗各种原因所致的白细胞减少症、血小板减少症等疾病；同时，次黄嘌呤也是合成抗恶性肿瘤药6-巯嘌呤和硫唑嘌呤的重要中间体。此外，次黄嘌呤是一种具有珠光特性的生物色素，安全无毒，不仅可用作食品色素、化妆品颜料及装饰品辅助添加剂，还有保鲜作用。在农业生产上，次黄嘌呤具有杀菌作用，可用作农药中间体。
3.目前次黄嘌呤的合成方法主要有天然提取法、化学合成法、化学酸法水解、腺嘌呤重氮化水解等。其中：
4.(1)天然原料提取法是基于次黄嘌呤广泛地分布于动物各种组织，如脑组织、肌肉组织和软组织等之中，通过直接从动物组织中提取的方法获得。该方法的优点是：来源广泛，原料易得，但是该方法提取过程复杂、产率低、代价昂贵。
5.(2)化学合成法是将氰乙酸乙酯与乙醇钠、硫脲经环合反应得到2-巯基-4-氨基-6-羟基嘧啶，再经亚硝化、还原、消除、环合，制得次黄嘌呤，该方法虽然原料易得，但是存在反应流程复杂、反应产率低、设备要求高等问题本发明以水反应溶剂，绿色温和，无毒无害。
6.(3)化学酸法水解肌苷获得次黄嘌呤工艺，酸用量较多，废水处理困难；且反应过程中容易出现副产，副产的分离较难，不适于大规模工业生产。
7.(4)腺嘌呤重氮化水解合成次黄嘌呤，使用大量酸，副产大量盐废水处理困难，产品外观也不好。
8.因此研究方法简单、产率高、副反应少的新型制备方法仍然是本领域的重要课题。


技术实现要素：

9.本发明需要解决的技术问题是提供一种酶法合成次黄嘌呤的方法，以解决现有技术存在的上述技术问题。
10.本发明是采用如下技术方案实现的：
11.一种酶法合成次黄嘌呤的方法，包括以下步骤：将腺嘌呤溶于适量水中，加入有效量的脱氨酶，30～50℃下保温反应，反应结束后用酸调ph到6.5-7，过滤水洗得次黄嘌呤。
12.其具体反应式如下：
[0013][0014]
优选的，所述脱氨酶来源于methanosarcina acetivorans c2a(嗜乙酸甲烷八叠球菌)的腺嘌呤脱氨酶，所述腺嘌呤脱氨酶能够催化腺嘌呤获得次黄嘌呤。
[0015]
优选的，重组质粒包括表达载体连接所述腺嘌呤脱氨酶的核苷酸序列。
[0016]
优选的，宿主细胞包含重组质粒，所述宿主细胞为大肠杆菌，所述腺嘌呤脱氨酶的基因序列为seq id.1，所述腺嘌呤脱氨酶的基因序列用于在大肠杆菌中表达。
[0017]
所述脱氨酶是通过数据库(ncbi生物数据库)挖掘获得蛋白的核苷酸序列，分别连接质粒中，得到重组质粒，转化获得重组菌；培养重组菌，诱导表达重组蛋白，匀质破碎离心得到所述脱氨酶。具体制备方法如下：将来自methanosarcina acetivorans c2a的腺嘌呤脱氨酶基因(nc_003552.1:2843256-2844917)委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成并整合到质粒pet-28a(+)zb04293，转化于大肠杆菌bl21 de3中表达，腺嘌呤脱氨酶基因序列seq id.1如下：
[0018]
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[0019]
将得到的重组菌株接种到lb培养基中，在37℃下振荡培养7小时，取振荡培养后的
培养基以1-2％的接种量转接于tb培养基中，在35-40℃振荡培养至od600达到0.6，加入终浓度为1mmol/l的iptg，于20-30℃培养5-15h，培养结束后在7000rpm、15min下离心收集细胞，向收集的细胞中加入磷酸缓冲液重悬细胞，于冰浴中超声波破碎，收集上清液冷冻干燥即得所述脱氨酶冻干粉。
[0020]
发明人意外的发现，采用腺嘌呤为原料，通过脱氨酶可一步合成次黄嘌呤，反应条件温和，无副产物，且产品收率高，纯度高，其中，收率为96.0～99.0％，纯度为99.0～99.8％。发明人基于上述发现完成本发明。
[0021]
优选的，所述脱氨酶的加入量为腺嘌呤质量的0.3-0.5％。
[0022]
优选的，保温反应的时间为8-18小时。
[0023]
优选的，将腺嘌呤溶于水配成质量百分比浓度为2％-15％的溶液。
[0024]
优选的，所述酸为无机酸，具体可选自盐酸、稀硫酸中的至少一种。
[0025]
本发明以腺嘌呤为原料，采用脱氨酶法合成次黄嘌呤，克服了天然原料提取法提取过程复杂、产率低、成本高的缺陷，和其他化学合成法相比，无副产物，收率和纯度均较高，具有很好的推广应用价值。
具体实施方式
[0026]
以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优选实施例只作为举例，但不用来限制本发明的范围，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型。在以下描述中界定的本发明的基本原理可以应用于其他实施方案、变形方案、改进方案、等同方案以及没有背离本发明的精神和范围的其他技术方案。
[0027]
本发明中的仪器或原料未注明生产厂商的，均为常规商业化仪器或原料。其中脱氨酶采用如下方法制备：
[0028]
将来自methanosarcina acetivorans c2a的腺嘌呤脱氨酶基因(nc_003552.1:2843256-2844917)委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成并整合到质粒pet-28a(+)zb04293，转化于大肠杆菌bl21 de3中表达，基因序列如下：
[0029]
atgaaaaagtacctggggattattgtcgatgccgtttccaggcggcagttcaaaggcgagattaccgttgaaaacggaaagatcctgcgtgttgaagaaaaggaacacgatcatgagcggtacatcctgcccgggcttgttgacgcccatgtgcatatagagagttccatgaccgtgccctcggtttttgcccggatggctgttgcaaaagggacggttgccgtggtcagcgatcctcatgagattgcaaacgttatgggggaagagggtattgatttcatgcttggggattcgaaaagatcccctctgaaagtcttttttggggtaccctcctgtgtgccggcaactccattcgaatccgcaggatcagtccttgatgcggaggctgttgaccgcctgctggcaagagaggacctgtattacctttccgagatgatgaatttccctggtgtggttctgggattccccgatgtaatggcaaaactggagtccgcaaaaaagtgtggcaaagtgatcgatggacacgcgcctggcctaaggggagccgacctcgagacatacatcggggtagggatttccacagaccatgaatcttttacttacgaagaagcagttgaaaaaataaaactcgggatgaaaatccttatccgggaagggagttcagcccgaaatttcgaaaccctgtacagcctgatagatgaatatcccgaagcggtcatgctctgcaccgacgactctcaccccgataccctgatctatgaggggcatatcgacaagctgatccggcgcgggcaggaaaagggacttgatatctttaaccttatcagggcagcggtgatcaacccggtagagcattacgggctcaatgtcgggctgctgcgtgaaggtgaccctgcggatttcatcaccgtggacgacctgaagtccttcaacgtgctgagtaccttcatcgacggagaatgtgtttacgagaacggaaaggttcttttccctatgaaaaaagttcctgcaaaaaacgtgttcaaccgaaataaaatttcaatcgatgctgcaaaactggctgtgccggc
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[0030]
将得到的重组菌株接种到lb培养基中，在37℃下振荡培养7小时，取振荡培养后的培养基以1-2％的接种量转接于tb培养基中，在35-40℃振荡培养至od600达到0.6，加入终浓度为1mmol/l的iptg，于20-30℃培养5-15h，培养结束后在7000rpm、15min下离心收集细胞，向收集的细胞中加入磷酸缓冲液重悬细胞，于冰浴中超声波破碎，收集上清液冷冻干燥即得所述脱氨酶冻干粉。
[0031]
本发明实施例中涉及的检测指标如未提及，均采用本领域常规检测方法进行检测。次黄嘌呤的纯度采用高效液相色谱仪检测，色谱条件具体为：色谱柱：c18 250*4.6mm,5um；柱温：30℃；检测波长：256；流速：1ml/min；进样量：20ul；流动相：0.02mol/l kh2po4溶液(稀磷酸调ph到2.5)：甲醇＝97.5:2.5。
[0032]
实施例1
[0033]
将50g腺嘌呤，0.25g脱氨酶和500g水加入1000ml的三口瓶中，搅拌控温40℃，保温反应8小时，用工业盐酸调ph6.5-7，反应结束，过滤水洗得干燥次黄嘌呤49.5g。收率为99.0％，纯度为99.8％。
[0034]
实施例2
[0035]
将50g腺嘌呤，0.15g脱氨酶和500g水加入1000ml的三口瓶中，搅拌控温35℃，保温反应12小时，用工业盐酸调ph6.5-7，反应结束，过滤水洗得干燥次黄嘌呤49g。收率为98.0％，纯度为99.0％。
[0036]
本领域的技术人员应理解，上述实施例只作为举例而并不限制本发明。本发明的目的已经完整并有效地实现。本发明的功能及结构原理已在实施例中展示和说明，在没有背离所述原理下，本发明的实施方式可以有任何变形或修改。