重组酵母菌及其应用的制作方法

本发明涉及用于生成乳糖-n-三糖的重组酵母及其应用，属于生物工程领域。

背景技术：

1、母乳低聚糖（human milk oligosaccharides，hmos）是一类复合低聚糖，由单糖及衍生物、唾液酸等结构单元通过糖苷键连接而成。然而，人们对它的认知却历经一百多年。

2、早在1886年，澳大利亚儿科医生和微生物学家escherich就发现婴儿肠道细菌与消化功能存在联系。1900年，moro和tissier两位研究者分别证实母乳喂养和人工喂养的婴儿粪便中细菌组成不同。是否母乳中特殊存在的成分是导致婴儿肠道细菌不同的原因，基于此，1926年， schönfeld发现母乳的乳清中含有促进两歧双歧杆菌生长的益生因子。那么，究竟是乳清中的那些成分是促进双歧杆菌的生长的因素。1930年，法国科学家polonowski和lespagnol从母乳乳清中检测到具有碳水化合物特征的组分，命名为“gynolactose（乳寡糖）”。1954年，györgy证实促进双歧杆菌增长的因子“双歧因子”实为低聚糖。同年，polonowski和montreuil两位科学家采用二维纸色谱分析法从乳寡糖中分离出低聚糖。1983年，egge等用快速原子轰击质谱法确认了hmos；1999年，coppa等人在母乳喂养的婴儿粪便中检测到30-50%的hmos以其原始结构形态存在；2000年，有学者发现hmos可耐受婴儿消化道内酶的水解，这一现象充分说明人乳寡糖的生物作用并非单纯的为婴儿提供物质和能量。

3、hmos添加的婴幼儿配方奶粉以及膳食补充剂等，已经在美国、欧盟、澳大利亚和新西兰等国家市场上销售。

4、目前，欧盟efsa、美国fda均批准了乳糖-n-四糖（lacto-n-tetraose，lnt）、乳糖-n-新四糖（lacto-n-neotetraose ，lnnt）的上市，批准上市的乳糖-n-四糖（lnt）、乳糖-n-新四糖（lnnt）均采用微生物发酵法生产。

5、21世纪以来，随着研究方法的进步，科学家发现母乳总hmos（酸性和中性低聚糖）浓度随泌乳期延长而下降； hmos可促进婴儿肠道微生态平衡，促进肠道内有益菌的增殖、抑制有害菌的生长、抵御病原菌感染，阻碍致病菌的定殖、预防炎症性大肠疾病和胃肠炎、调节免疫系统和促进婴儿的认知发育等，无论从当前还是长远来看， 其对婴儿的生长发育，健康都非常重要。因此，及时足量的补充hmos将有利于维护婴幼儿的健康成长。然而，hmos的合成一直是合成生物学/化学工作者面临的巨大挑战，从生物体内糖链的合成来看，这类分子的合成不是单一模板的复制，而是需要多种糖基转移酶和糖苷酶共同调控，这也就决定了糖链结构的复杂性、多样性和微观不均一性。可喜的是，随着糖化学和重组酶学的快速发展，以及糖化学家和糖生物学家在糖合成领域所做的大量工作，相继报道了一系列合成寡糖的新方法和策略。

6、乳糖-n-三糖（英文名称 lacto-n-trioseii ，简称lntii，又称glcnac-β1, 3-gal-β1, 4-glc，cas：75645-27-1，化学结构式如式1）。

7、。

8、lntii不仅是hmos的一种重要的寡糖，而且也是合成乳糖-n-四糖（lacto-n-tetraose，lnt）、乳糖-n-新四糖（lacto-n-neotetraose ，lnnt）的重要前体。因此，安全性好、特异性高的可持续的lntii生产技术对于hmos的产业化显得尤为重要。lntii可由酶催化n-乙酰氨基葡萄糖（glcnac）和β-乳糖形成β-1,3-糖苷键合成（nyffenegger等，backbonestructures in human milk oligosaccharides: trans-glycosylation by metagenomicβ-n-acetylhexosaminidases. applied microbiology andbiotechnology, 2015; 99:7997-8009）。虽然有文献公开了lntii的制备技术或制备策略，对于结构相对复杂的寡糖的合成，其工作量仍然很大，收率不高，同时对寡糖化合成中立体和区域选择性的控制也是困扰化学合成的难题。

9、生物合成技术因特异性高、可规模化量产等优点近年来受到广泛关注，利用生物技术绿色高效的合成乳糖-n-三糖(lntii)是生物工作者在努力探索的重要课题。

10、目前关于人乳寡糖的合成主要有细胞工厂和酶催化两种策略。酶催化法虽然具有反应副产物少、可控性强的优势，但是其催化效率较低，如专利cn202010386045.2 公开了 haloferulasp.来源的β-n-乙酰氨基己糖苷酶在合成lntii中的应用，其利用底物-几丁质作为氨糖供体，其转化率仅有14%以下，从而严重限制了其在工业上的应用。而全细胞催化直接利用体内高能的活化底物形式，如udp-glcnac，是一种更容易实现高转化效率的方法，如中国专利cn201680052611.8公开了一种经遗传修饰的微生物宿主细胞产生所需寡糖的方法，cn202010834657.3公开了一种提高lntii的基因工程菌及生产方法，其乳糖转化率能够达到75%或者以下，但是目前已报道生产lntii的宿主的主要以大肠杆菌居多，但是大肠杆菌内毒素的去除是大规模工业生产中的一个重大挑战。内毒素又称为脂多糖，是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，可以引发人体如发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等症状。因此，寻找产量稳定、生产效率高，且安全性好的宿主合成人乳寡糖之一lntii的合成，对于人乳寡糖的产业化应用和推广具有十分重要的价值。

技术实现思路

1、发明目的：针对现有的技术难点及存在的问题，提供一种安全性好、特异性高并且绿色可持续的生物合成法。

2、本文描述的是包含与乙酰氨基葡萄糖基转移酶β-n-acetylglucosaminyltransferase基因相关的修饰的微生物菌株。

3、在一个方面，本发明提供了用于催化生成乳糖-n-三糖（lntii）的酶。所述用于催化生成乳糖-n-三糖（lntii）的酶，根据carbohydrate-active-enzymes即cazy数据库分类，属于糖苷水解酶28家族。所述糖苷水解酶28家族的酶，为乙酰氨基葡萄糖基转移酶β-n-acetylglucosaminyl transferase。

4、所述催化生成乳糖-n-三糖（lntii）的酶，优选的，来自于脑膜炎奈瑟氏菌( neisseria meningitidis)，ec no:2.4.1.56； genebank编号aac44084.1，其氨基酸序列如seqid no:1所示；或包含seq id no:1所示氨基酸序列，或与seq id no:1具有至少70%的氨基酸序列一致性，或包含与seq id no:1具有至少70%的氨基酸序列一致性。

5、所述催化生成乳糖-n-三糖（lntii）的酶，优选的，来源于幽门螺旋杆菌 helicobacter pylori，ec no: 2.4.1.129； genebank编号wp000199766.1；其氨基酸序列如seq id no:2所示；或与seqid no:2具有至少70%的氨基酸序列一致性，或包含seq idno:2所示氨基酸序列，或包含与seq id no:2具有至少70%的氨基酸序列一致性。

6、所述催化生成乳糖-n-三糖（lntii）的酶，优选的，来源于肠道沙门氏菌( salmonella enterica) , ec no: 2.4.1.155； genebank编号wp_140239824.1，其具有seq id no:3 所示氨基酸序列；或与seqid no:3具有至少70%的氨基酸序列一致性，或包含seq id no:3所示氨基酸序列，或包含与seq id no:3具有至少70%的氨基酸序列一致性。

7、所述生成乳糖-n-三糖的酶，包括氨基酸序列与seq id no:1、或seq id no:2、或seq id no:3具有至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少100%的序列一致性的酶，且具有产生乳糖-n-三糖的活性。

8、如附图1所示，seq id no:1与seq id no:2 与seq id no:3的差异较大。seq idno:1与seq id no:2的氨基酸序列一致性为12.5%。seq id no:1与seqid no:3的氨基酸序列一致性为44.44%，seq id no:2与seq id no:3的氨基酸序列一致性为5.28%。

9、在一些实施例中，本发明描述了一种重组细胞，其包含一种或多种(例如两种、若干种)异源多核苷酸。优选的，所述异源多核苷酸选自编码乙酰氨基葡萄糖基转移酶的异源多核苷酸，其具有生成lntii的能力。

10、所述重组细胞，优选的，包含上述seq id no:1和/或seq id no:2和/或seq idno:3所示用于生成乳糖-n-三糖的酶的氨基酸序列及其编码核酸序列

11、在一些实施例中，本发明描述了以酵母细胞为宿主，借助其自身的代谢途径并导入异源的糖苷水解酶28家族的乙酰氨基葡萄糖基转移酶，高效合成了乳糖-n-三糖（lac-n-triose ii，lntii）。

12、在一些实施例中，所述重组细胞是酵母细胞 ，例如假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞；进一步优选的，为酿酒酵母 （saccharomyces cerevisiae）、乳酸克鲁维酵母( kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母( kluyveromyces marxinus)、解脂耶氏酵母( yarrowia lipolytica)、禾本红酵母( rhodotorula graminis) 、巴氏酵母 ( saccha romyces pastorianus)等细胞；酿酒酵母 （saccharomyces cerevisiae）、乳酸克鲁维酵母( kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母( kluyveromyces marxinus)和解脂耶氏酵母( yarrowia lipolytica)均为通过美国食品药物管理局gras食品安全认证的酵母细胞，在食品或食品添加剂安全管理方面，更容易被接受。

13、本发明提供了乳糖-n-三糖（lntii）的新型生产工艺，可以通过发酵简便合成乳糖-n-三糖（lntii），既简化了合成步骤，同时还提高了目的产物的安全性。

14、在一个方面，所述重组酵母，包含(1)能够产生乳糖-n-三糖的乙酰氨基葡萄糖基转移酶和(2)对标志物基因的破坏。

15、术语“ 破坏”意指参考基因的编码区和/或控制序列被部分或完全修饰(例如通过缺失、插入和/或取代一个或多个核苷酸)，从而使得编码的多肽的表达不存在(失活)或降低，和/或编码的多肽的酶活性不存在或降低。可以使用本领域已知的技术测量破坏效果，如使用来自在此参考的无细胞提取物测量值检测乳糖消耗量的不存在或降低。

16、所述标志物基因，包含β-半乳糖苷酶或者β-半乳糖苷酶的部分氨基酸序列，与seqid no:4和/或seq id no:5至少50%、至少51%、至少52%、至少53%、至少54%、至少55%、至少60%、至少61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少100%的氨基酸序列一致性。

17、优选的，所述重组酵母，为乳酸克鲁维重组酵母细胞；进一步优选的，其包含至少一个标志物基因被破坏，并且含有所述标志物的氨基酸序列，以及编码所述标志物的核酸序列。所述标志物基因的核酸序列genebank编号m84410.1；其氨基酸序列genebank编号aaa35265.1。

18、优选的，所述重组酵母，为马克斯克鲁维重组酵母细胞；进一步优选的，其包含至少一个标志物基因被破坏，并且包括所述标志物的氨基酸序列，以及编码所述标志物的核酸序列。所述标志物基因的核酸序列genebank编号xm_022818497.1；其氨基酸序列genebank编号xp_022675157.1。

19、在一个实施例中，所述标志物基因为β-半乳糖苷酶基因 lac4。所述标志物基因的破坏，优选的，是指 lac4基因的破坏。所述 lac4基因的破坏，优选的，是指部分标志物基因的破坏。

20、所述重组乳酸克鲁维酵母菌株，优选的，为乳酸克鲁维重组酵母菌株kl-nmlgta和/或kl-selgta和/或kl-hplgta。

21、所述重组马克斯克鲁维重组酵母菌株，优选的，为马克斯克鲁维重组酵母菌株km-nmlgta和/或km-selgta和/或km-hplgta。

22、优选的，本发明所述重组乳酸克鲁维酵母菌株strainkl-2-02，其分类命名为：乳酸克鲁维酵母hllwf3(kluyveromyces lactis hllwf3)，于2022年2月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为:cctcc no:m 2022118。

23、……

24、优选的，本发明所述重组酵母，可通过紫外诱变方法对其进行遗传学改造，进一步提高lntii的产量。

25、本发明还提供了所述的重组酵母细胞的表达方法，包括：(a)培养亲本菌株； (b)破坏在(a)的亲本菌株中的标志物基因；(c) 导入能够产生乳糖-n-三糖的酶；优选的，还包括(d)分离所述重组菌株的步骤。

26、所述 “亲本”或“ 亲本菌株”，是指对其进行破坏以产生在此描述的重组菌株的菌株。亲本可以是天然存在的(野生型)或预先修饰的菌株。

27、优选的，所述酵母菌株为克鲁维酵母（ kluyreromycessp.）菌株；更优选的，为乳酸克鲁维酵母菌株 k. lactic和/或马克斯克鲁维酵母 k. marxianus；进一步优选的，为乳酸克鲁维酵母菌株 k. lacticdsm70799和/或马克斯克鲁维酵母 k. marxianusdmku3-1042。

28、本发明所述乳酸克鲁维重组酵母菌株以及马克斯克鲁维重组酵母菌株在制备乳糖-n-三糖lntii中的应用，其自身代谢合成的udp-乙酰葡萄糖胺（udp-glcnac）和乳糖为反应供体，在异源导入的28家族糖苷水解酶的催化下生成乳糖-n-三糖(lntii)。

29、本发明还提供了所述乳酸克鲁维重组酵母和/或马克斯克鲁维重组酵母在生成乳糖-n-三糖方面的应用。

30、优选的，所述应用的培养基是含水溶液；更优选的，所述应用的培养基是含有乳糖和/或葡萄糖和/或果糖和/或蔗糖和/或半乳糖的水溶液。优选的，所述含水溶液需添加所述乳酸克鲁维重组酵母菌株和/或马克斯克鲁维重组酵母菌株。

31、优选的，所述应用的培养温度为15-60℃；进一步优选的，所述应用的培养温度为28-32℃。

32、优选的，所述重组酵母在生成乳糖-n-三糖方面的应用，培养基中还含有无机盐和/或微量元素；优选的，所述无机盐和/或微量元素选自磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铵、硫酸锰、硫酸钾或它们的任意组合；优选的，所述无机盐或微量元素的终浓度为3-7mm。

33、本发明还提供了所述乳糖-n-三糖（lntii）的生产方法，该方法包括：(a)在适合的条件下，在可发酵的培养基中培养所述重组酵母细胞，以生产乳糖-n-三糖（lntii）；并且(b)回收该乳糖-n-三糖（lntii）。

34、所述乳糖-n-三糖（lntii）的生产方法，优选的，通过添加活性炭等方法进行分离纯化后，得到的lntii。

35、所述乳糖-n-三糖（lntii）的生产方法，优选的，利用所述重组酵母进行混合发酵，获得lntii。

36、术语解释：术语“序列一致性”是指两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性，通过参数“序列一致性”来描述，又称“序列一致性”。

37、术语“宿主细胞”意指对用核酸构建体或表达载体进行的转化、转染、转导等是易感的任何细胞类型。术语“ 宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。

38、术语“重组细胞”定义为包括一种或多种(例如，两种、若干种)异源多核苷酸的非天然存在的宿主细胞。宿主细胞可以是在此描述的突变菌株，或被进一步破坏以提供在此描述的突变菌株。

39、有益技术效果：

40、本发明提供了一种新的乳糖-n-三糖(lntii)的制造方法，利用重组克鲁维酵母（乳酸克鲁维重组酵母和马克思克鲁维重组酵母）为细胞工厂，合成人乳寡糖中的lntii。与以往的方法，整个制造过程简单可控，生物安全性高，易扩大规模，原料来源广泛，产品制备成本低，实用价值高，以乳糖为底物合成乳糖-n-三糖(lntii)的转化率更高。

41、本发明证明了重组酵母细胞在实现人乳寡糖的高效生产方面具有巨大潜力，为乳糖-n-三糖(lntii)及其类似物的大规模工业生产奠定了基础，具有重要的经济价值和社会效益。除了安全性外，本发明所用原料易得，方法简便易行，适合产业化生产，具有优异的应用前景。