甘蓝型油菜Bna.Arf基因在提高植物生物量中的应用

甘蓝型油菜bna.arf基因在提高植物生物量中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及甘蓝型油菜bna.arf基因在提高植物生物量中的应用。


背景技术：

2.随着国民经济水平提高，我国对优质的脂质和蛋白质的需求愈发旺盛，而油菜、大豆、芝麻等油料作物是脂质和蛋白质最重要的来源，在保证脂质和蛋白质的有效供给、改善食物结构、促进养殖业和加工业发展等诸方面均居重要地位。但是由于耕地资源紧张、品种品质良莠不齐、研发水平相对落后，我国油料的生产在质量和数量上都难以满足日益增长的需求。在实际生产中，我国油菜产量较低，生产成本却较高，超过百分之六十依赖进口，并且种植面积和单位面积产量都停滞不前。因此，探究有效提高油菜生物量积累的机制，培育油菜理想株型，对于提高油菜产量和保障我国作物食用油的供给安全具有重要意义。arf蛋白(adp-ribosylation factor，adp核糖基化因子)是一类在真核生物囊泡运输过程中具有重要作用的调节因子，并参与植物的生物和非生物胁迫响应。arf蛋白属于ras超家族，根据氨基酸序列同源性，将arf基因家族分为arf和arf-like(arl)基因，拟南芥中共鉴定出11个arf蛋白及21个arl蛋白，arf蛋白高度保守(》相似度60％)，具有相似的生物活性，而arl蛋白高度分化(40-60％相同)，在包括分泌在内的不同途径中发挥作用。前期研究发现arf在真核细胞中参与信号转导、细胞增殖、囊泡运输等多种生物学过程：pimpl通过体外复制囊泡生成实验发现花椰菜中arf1a和γ-copi可完成从细胞质到内质网/高尔基混合膜的转移；lee等利用gdp、gtp结合拟南芥arf1a突变体进行瞬时表达，发现细胞中内质网到高尔基体运输的中断,而gfp标记的高尔基膜标记蛋白重新进入内质网；myung ki等在拟南芥的高尔基体中沉默表达arf1，发现蛋白质运输受到抑制，同时植物的生长发育受到抑制；以上研究说明arf在植物生长发育和生物量形成过程中具有重要作用，但其具体调控途径，分子调控网络没有得到清晰的研究。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种甘蓝型油菜bna.arf基因在提高植物生物量中的应用。
4.为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
5.1、甘蓝型油菜bna.arf基因在提高植物生物量中的应用
6.所述甘蓝型油菜bna.arf基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
7.本发明优选的，所述植物为甘蓝型油菜或拟南芥。
8.本发明优选的，通过在植物中过表达甘蓝型油菜bna.arf基因来提高植物的生物量。
9.本发明优选的，所述生物量包括叶片面积、莲座叶数目、植株高度、有效分枝数、角果数、鲜重、干重。
10.本发明优选的，在植物中过表达甘蓝型油菜bna.arf基因的方法为将过表达载体pearleygate101-bna.arf通过农杆菌介导转化植物。
11.本发明进一步优选的，所述过表达载体pearleygate101-bna.arf的构建过程为：将seq idno.3所示的甘蓝型油菜bna.arf基因构建到pentr/d-topo入门载体上，并转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提取得到中间载体，将其与pearleygate101表达载体进行lr重组反应，得到过表达载体pearleygate101-bna.arf。
12.本发明优选的，在植物中过表达甘蓝型油菜bna.arf基因，能激活淀粉合成途径、蔗糖运输途径上相关基因的表达，提高能量物质的积累，从而提高植物的生物量。
13.本发明优选的，在植物中过表达甘蓝型油菜bna.arf基因，能激活激素代谢途径中生长素合成相关基因的表达，从而提高植物的生物量。
14.本发明的有益效果在于：本发明公开了甘蓝型油菜bna.arf基因在提高植物生物量中的应用，通过利用gus组织化学染色发现bna.arf基因在各个组织中都有表达，但在叶片、角果及花中表达量最高；利用扫描电镜探究了bna.arf过表达植株的叶片细胞大小与数量，发现过表达转基因植株的叶片细胞较野生型细胞面积显著增大；结合对转基因植株的农艺性状考察及转录组分析等结果，发现转基因bna.arf与野生型植株差异表达基因主要涉及生长素、细胞分裂素、脱落酸等激素相关的代谢途径，与淀粉合成、蔗糖转运等能量代谢相关途径，这些结果表明bna.arf能影响植株生物量大小，因此可将bna.arf用于调控植物生物量，将植物中过表达bna.arf基因使arf蛋白激酶活性增加，对植株生物量的增加具有重要意义。
附图说明
15.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
16.图1为bna.arf启动子在拟南芥中的表达情况(a-c为拟南芥营养生长期整株及根和叶的表达情况，d-g为抽薹以后在茎、花、角果皮中的表达情况，标尺长度为500μm)；
17.图2为营养生长时期转基因农艺性状考察(a：拟南芥种子比较；b-d：拟南芥植株叶片面积，叶片数目比较；e-g:分别为过表达株系与野生型种子面积，叶片面积，莲座叶数目的生物统计学分析)；
18.图3为生殖生长时期转基因农艺性状考察(a-c：生殖生长时期拟南芥生长情况比较；d-f：分别为过表达株系与野生型植株高度，有效分枝数，角果数的生物统计学分析；g-h:分别为过表达株系与野生型不同时期的鲜重，干重的生物统计学分析)；
19.图4为差异表达基因kegg富集top 20点状图。
具体实施方式
20.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
21.本发明使用材料如下试验材料：植株材料野生型拟南芥col-0，过表达bna.arf拟南芥转基因植株、实验所用菌株大肠杆菌dh5α、根癌农杆菌gv3101，载体pearleygate101、pcambia1305.1。
22.转录组材料：将过表达拟南芥及野生型拟南芥消毒点播于1/2ms培养基中，4℃冰箱放置两天使种子处于相同的生长状态后置于组培间16小时黑暗，8小时光照培养至四叶期，整个植株装入2ml无rna酶的离心管(每个材料取三个重复)迅速置于液氮中，冻存于-80℃备用。
23.实施例1、bna.arf基因克隆及表达情况
24.使用ez-10dna away rna mini-preps kit试剂盒按照说明书提取样品总rna，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测样品rna质量并检测rna浓度，使用us everbright inc.的反转录试剂盒进行反转cdna的合成。
25.利用油菜基因组网站brassica napus database(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)获取arf家族成员染色体位置信息，并根据bna.arf基因的orf序列设计引物，具体引物如下：
26.上游引物：5
’‑
atgggtttgtctttcgccaagttgtttag-3’(seq id no.1)；
27.下游引物：5
’‑
ctacgccttgccggcaatgttgttggac-3’(seq id no.2)；
28.然后以提取的cdna为模板，进行pcr扩增，扩增产物经测序得到543bp的cdna序列，具体序列如seq id no.3所示。
29.利用pentr/d-topo cloning kit，将扩增的bna.arf基因cdna序列重组到pentr/d-topo入门载体，转化大肠感受态dh5α。利用引物seq id no.1和seq id no.2鉴定阳性克隆后，使用easypure plasmid miniprep kit提取质粒，将其与pearleygate101表达载体进行lr重组反应，形成用于过量表达和亚细胞定位的pearleygate101-bna.arf载体。
30.根据bna.arf基因启动子序列，设计特异性引物(seq id no.4和seq id no.5)扩增启动子上游2000bp序列，具体序列如seq id no.6所示，通过重组法将其重组在pcambia1305.1载体上得到重组载体pcambia1305.1-bna.arf，获得重组载体转化农杆菌gv3101并侵染野生型拟南芥获得t2代转基因植株，利用gus组织化学染色法对其进行染色，结果显示，在拟南芥生长的各个时期各个组织部位都有一定的表达，且表达情况和brassicaedb网站(https://brassica.biodb.org/)预测结果一致：根据gus组织化学染色结果可以看出bna.arf具有组成型表达的特征，在各个时期各个部位都存在表达，但是表达量高低存在差异；在营养生长期中，叶片及根部存在少量表达；在生殖生长期间，叶片，茎，角果和花中均有较高表达量(如图1所示)。
31.实施例2、bna.arf对拟南芥生物量的影响
32.为了探究转基因拟南芥发生的变化，将pearleygate101-bna.arf通过农杆菌介导转化拟南芥，将过表达bna.arf拟南芥与野生型拟南芥在相同情况下培养后，对其株高、有效分枝数，角果数等性状进行考察。
33.在拟南芥从1/2ms培养基移栽在土里及后续的营养生长阶段，过表达植株叶片面积明显大于野生型植株，莲座叶数目多余野生型植株(如图2所示)；在拟南芥生殖生长时期，过表达拟南芥植株显著高于野生型植株，其有效分枝数，角果数目显著增多；分别测量不同时期过表达与野生型植株的鲜重和干重，发现过表达植株的生物量较野生型显著增多。结果表明，过表达拟南芥植株生物量显著大于野生型(如图3所示)。
34.实施例3、转录组结果分析
35.为了分析过表达bna.arf转基因植株的分子机制，揭示其生物量增加的原因，对抽
薹前期的过表达bna.arf转基因植株以及突变体atarf进行转录组测序，以同一时期野生型的转录组数据作为对照。研究利用相应的分析流程对转录组的测序结果进行分析；结果显示，在同一时期野生型拟南芥和过表达bna.arf转基因拟南芥植株中共鉴定出90个差异表达基因，对差异基因进行kegg富集分析，总共富集到了32个kegg条目共90个差异基因，富集的前20个主要可能调控的kegg通路，其中包括植物激素信号转导通路(plant hormone signal transduction)、蛋白质转运(protein export)、氮代谢途径(nitrogen metabolism)及丝裂原活蛋白激酶级联途径(mapk signaling pathway)等(如图4所示)。测序结果显示，过表达植株中，能量代谢途径相关基因表达量显著上调，说明在拟南芥中过量表达bna.arf能够激活淀粉合成途径，蔗糖运输途径以提高能量物质的积累来增加植物生物量。
36.在差异基因的kegg中，还富集到了植物激素信号转导通路(plant hormone signal transduction)，这个通路中相关的激素主要包括生长素、细胞分裂素、脱落酸等，富集的差异基因主要参与生长素代谢通路。这些基因主要调控细胞分裂、细胞增大等植株发育过程。
37.以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。